DNA 甲基化在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下的CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶，是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一。原核生物中甲基化 多發(fā)生在CCA/TGG和GATC序列；真核生物中DNA甲基化一般發(fā)生在CpG位點上；哺乳動物DNA甲基化只發(fā)生在CpG島的胞嘧啶,植物甲基化發(fā)生 在CpG和CpNpG。甲基化會使胞嘧啶轉(zhuǎn)為5-甲基胞嘧啶,CpG位點在基因組是不常見的，主要密集于接近基因啟動子的位置,統(tǒng)稱為CpG島。CpG位 點的甲基化可以對基因表現(xiàn)有重要的影響。

      DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表 達。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導(dǎo)了基因重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列的前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。

      目前，甲基化檢測的主要研究方法是基于亞硫酸氫鹽處理的甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)和亞硫酸氫鹽測序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)。 除此之外，還有高分辨率熔解曲線法(High Reso- lution Melting,HRM)和焦磷酸測序法。
     
      MSP
      甲 基化特異性的PCR是一種靈敏度高且操作相對簡單的甲基化研究方法。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有 未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物,如果用針 對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。
       

該方法具有以下優(yōu)點:       1、檢測靈敏度高,樣品消耗少,僅需1μg的gDNA；       2、快速、簡單,省時；       3、可結(jié)合Real-time PCR技術(shù)(Taqman 探針) 對樣品中檢測位點甲基化水平進行定量。

      BSP
      亞 硫酸鹽測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化 的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿 嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶。最后對PCR產(chǎn)物進行測序，可以判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進行測序，可以提高測序成功率，這種方 法稱為BSP-克隆測序法。

該方法具有以下優(yōu)點:       1、特異性高：能提供高特異性分析結(jié)果，是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比擬的；       2、靈敏度高：可以用于分析少于100個細胞的檢測樣品。用微量的gDNA進行分析就能得到各個DNA分子精確的甲基化位點。

HRM       高分辨率熔解曲線法，是近年來興起的甲基化檢測的新方法。 在非CpG島位置設(shè)計 一對針對亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化,用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞 嘧啶經(jīng)PCR擴增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變,樣品中的GC含量發(fā)生改變,從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

      焦磷酸測序法
      焦 磷酸測序(Pyrosequencing)技術(shù)是由4種酶(DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfu- rytase)、熒光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase))催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。每 一輪測序反應(yīng)體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果該dNTP與模板配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3'末端,同時釋 放出一個分子的焦磷酸(PPi)。摻入的dNTP和釋放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸測序檢測法基于引物延伸的Pyrosequencing技 術(shù)，通過將鏈合成過程中釋放出的焦磷酸(PPi)轉(zhuǎn)化成光信號來監(jiān)測鏈的合成過程。通過檢測CpG對應(yīng)位點上C/T滲入的比例對目標位點的甲基化程度進行 定量分析方法。

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