cfDNA甲基化模式追溯肝臟移植后同種異體移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源
近日，美國(guó)華盛頓喬治敦大學(xué)（Georgetown University）Anton Wellstein和Alexander Kroemer團(tuán)隊(duì)合作，研究了循環(huán)細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）的甲基化模式在肝臟移植后同種異體移植物（allograft）損傷中的應(yīng)用。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)44名肝臟移植患者的130份血液樣本進(jìn)行cfWGBS分析，利用cfDNA片段甲基化模式，追溯其細(xì)胞來(lái)源，從而揭示移植物損傷的細(xì)胞基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，cfDNA甲基化模式能夠非侵入性地指示肝臟移植后移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源，并區(qū)分不同類型的移植物損傷。相關(guān)研究成果以《Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant》為題發(fā)表于《Nature Communications》期刊。
標(biāo)題：Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant（cfDNA甲基化模式揭示肝臟移植后同種異體移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源）
發(fā)表時(shí)間：2025年06月17日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：cfWGBS（易基因金牌技術(shù)）
移植后的并發(fā)癥會(huì)降低同種異體移植物和受者的存活率。目前用于非侵入性檢測(cè)移植器官損傷的方法有限，且無(wú)法區(qū)分細(xì)胞機(jī)制。本研究通過(guò)分析肝臟移植后由死亡細(xì)胞釋放到循環(huán)細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）片段，來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞損傷。研究分析了44名患者在移植后不同時(shí)間點(diǎn)采集的130份血液樣本。將基于序列的cfDNA片段甲基化模式比對(duì)到一個(gè)由476個(gè)純化細(xì)胞的甲基化組（methylomes）來(lái)源細(xì)胞類型特異性（cell-type-specific）DNA甲基化模式圖譜中。肝臟細(xì)胞類型的DNA甲基化模式和多組學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析表明在開放染色質(zhì)和功能重要的調(diào)控區(qū)域有顯著富集。在沒(méi)有移植器官損傷的患者中，多組織細(xì)胞損傷在術(shù)后第一周內(nèi)恢復(fù)。然而，如果在術(shù)后第一個(gè)月內(nèi)持續(xù)檢測(cè)到肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA升高，則表明存在早期移植器官損傷。此外，cfDNA組成變化可以區(qū)分移植器官損傷的不同原因，顯示出非侵入性監(jiān)測(cè)和干預(yù)的潛力。
易小結(jié)
本研究提供了一種新的非侵入性方法，通過(guò)分析血液中的cfDNA甲基化模式來(lái)監(jiān)測(cè)肝臟移植后的移植物損傷。這種方法不僅可以早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，還可以區(qū)分損傷的不同原因，為臨床醫(yī)生提供了一種新的工具，以更精準(zhǔn)地監(jiān)測(cè)和干預(yù)肝臟移植后的并發(fā)癥。此外，該方法還能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)其他器官的損傷，如腎臟、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)，為多器官移植后的全面監(jiān)測(cè)提供了可能。
（詳見→深度綜述：cfDNA甲基化在器官和組織損傷檢測(cè)中的強(qiáng)大力量）
cfWGBS技術(shù)在本研究中不僅提供了單堿基分辨率的DNA甲基化信息，還通過(guò)多組學(xué)數(shù)據(jù)整合和片段反卷積分析，精確追溯cfDNA細(xì)胞來(lái)源，并揭示移植物損傷的早期標(biāo)志。這種方法為非侵入性監(jiān)測(cè)器官移植后的細(xì)胞損傷提供了一種新的、有效的手段，具有重要的臨床應(yīng)用前景。
研究方法
結(jié)果圖形
1. 肝臟移植后cfDNA甲基化模式提示的細(xì)胞損傷
為監(jiān)測(cè)肝臟移植后的細(xì)胞損傷，研究團(tuán)隊(duì)28名成年肝臟移植患者中的圍移植期收集連續(xù)血液樣本，并在移植后至多一個(gè)月的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣本進(jìn)行了cfDNA甲基化分析（n=100份樣本）。還從出現(xiàn)并發(fā)癥的患者身上收集了樣本，并在因臨床指征進(jìn)行肝活檢（for-cause liver biopsy, FC-bx）以鑒定移植物損傷時(shí)，收集16名患者的匹配表型樣本（n=30份樣本）。從這130份樣本中分離出cfDNA片段經(jīng)亞硫酸鹽處理，通過(guò)WGBS測(cè)序分析將cfDNA片段化組織和細(xì)胞類型來(lái)源比對(duì)到擴(kuò)展型細(xì)胞類型特異性DNA甲基化圖譜中，來(lái)推斷組織損傷并區(qū)分移植物損傷的不同原因（圖1）。
研究結(jié)果表明，肝臟移植后cfDNA濃度顯著增加，主要來(lái)源于肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞類型的cfDNA增加與手術(shù)過(guò)程中的細(xì)胞損傷相關(guān)。此外還檢測(cè)到神經(jīng)元和心肌細(xì)胞cfDNA的增加，表明移植手術(shù)可能對(duì)多個(gè)器官造成損傷。
圖1：使用血液中的cfDNA甲基化模式監(jiān)測(cè)肝臟移植后的細(xì)胞損傷研究概述。
2. 擴(kuò)展健康組織的基于測(cè)序DNA甲基化圖譜以表征肝細(xì)胞類型特異性表觀基因組
研究團(tuán)隊(duì)擴(kuò)展了現(xiàn)有的DNA甲基化圖譜，包括肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，如肝星狀細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和肝駐留免疫細(xì)胞。通過(guò)全基因組甲基化測(cè)序（WGBS），生成了這些細(xì)胞類型的甲基化圖譜，為后續(xù)分析提供參考。
研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞類型特異性的低甲基化區(qū)域與染色質(zhì)可及性和H3K27ac結(jié)合區(qū)域高度重合，表明這些區(qū)域在維持細(xì)胞類型特異性功能中具有重要作用。這些區(qū)域的甲基化模式可以作為細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。
c. 在相同細(xì)胞類型的chromHMM注釋中，與H3K4me1標(biāo)記相關(guān)標(biāo)記為增強(qiáng)子的細(xì)胞類型特異性低甲基化區(qū)域比例。
d. UCSC基因組瀏覽器比對(duì)顯示一個(gè)包含F(xiàn)OXA1結(jié)合序列的肝細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域。紫色軌跡顯示W(wǎng)GBS樣本的平均甲基化。
e. HOMER motif分析在肝細(xì)胞類型特異性低甲基化區(qū)域中富集先鋒（Pioneer）和發(fā)展（development）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。肝細(xì)胞的DHS、H3K27ac和H3K4me1數(shù)據(jù)來(lái)自德國(guó)表觀基因組計(jì)劃（DEEP）。肝細(xì)胞的FOXA1 ChIP-seq數(shù)據(jù)來(lái)自ENCODE項(xiàng)目。膽管上皮細(xì)胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)和肝星狀細(xì)胞的H3K27ac組蛋白修飾數(shù)據(jù)來(lái)自ENCODE項(xiàng)目。
4. 先鋒轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）在肝細(xì)胞類型特異性DNA甲基化區(qū)域富集
通過(guò)motif分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞類型特異性的DNA甲基化區(qū)域富含先鋒轉(zhuǎn)錄因子（如FOXA1/2、PAX7等）的結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞發(fā)育和命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，其結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可能影響基因表達(dá)（圖3d、e）。
5. 肝臟移植后立即出現(xiàn)的細(xì)胞損傷來(lái)源
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析肝臟移植后立即采集的血液樣本，發(fā)現(xiàn)cfDNA的主要來(lái)源是肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞類型的cfDNA增加與手術(shù)過(guò)程中的細(xì)胞損傷相關(guān)。此外，還檢測(cè)到神經(jīng)元和心肌細(xì)胞cfDNA的增加，表明移植手術(shù)可能對(duì)多個(gè)器官造成損傷。
6. 肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA的持續(xù)升高表明移植物損傷
研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第一個(gè)月內(nèi)，持續(xù)檢測(cè)到肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA的升高與移植物損傷相關(guān)。這些cfDNA升高可以作為早期診斷移植物損傷的非侵入性標(biāo)志物。
7. 細(xì)胞游離cfDNA甲基化追溯移植物損傷來(lái)源
通過(guò)分析cfDNA的甲基化模式，研究團(tuán)隊(duì)能夠區(qū)分肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞來(lái)源的損傷，從而確定移植物損傷的具體類型。這種方法可以為臨床醫(yī)生提供更精準(zhǔn)的診斷工具，減少對(duì)侵入性活檢的依賴。
討論和啟示
本研究結(jié)果表明，cfDNA甲基化模式可以作為非侵入性監(jiān)測(cè)肝移植后移植物損傷的有力工具。通過(guò)擴(kuò)展的DNA甲基化圖譜和多組學(xué)數(shù)據(jù)整合，研究團(tuán)隊(duì)不僅能夠早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，還可以區(qū)分損傷的不同原因，為臨床醫(yī)生提供了更精準(zhǔn)的診斷工具。此外，該方法還可以同時(shí)監(jiān)測(cè)其他器官的損傷，為多器官移植后的全面監(jiān)測(cè)提供了可能。
cfWGBS在本研究中的作用
生成細(xì)胞類型特異性的DNA甲基化圖譜：研究團(tuán)隊(duì)利用WGBS技術(shù)生成多種肝細(xì)胞類型（包括肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞）的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜。使研究者能夠精確地識(shí)別和量化不同細(xì)胞類型中的甲基化狀態(tài)。這對(duì)于區(qū)分不同細(xì)胞來(lái)源的cfDNA片段至關(guān)重要。
驗(yàn)證甲基化模式與細(xì)胞功能的相關(guān)性：通過(guò)將WGBS數(shù)據(jù)與染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）和組蛋白修飾（H3K27ac）數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了肝細(xì)胞類型特異性的低甲基化區(qū)域與染色質(zhì)可及性和功能重要的調(diào)控區(qū)域的重合。這些區(qū)域在維持細(xì)胞類型特異性功能中具有重要作用。
追溯cfDNA的細(xì)胞來(lái)源：研究團(tuán)隊(duì)利用WGBS生成的甲基化圖譜，通過(guò)片段反卷積分析推斷cfDNA片段的細(xì)胞來(lái)源。這種方法能夠精確地識(shí)別cfDNA片段的組織和細(xì)胞類型，從而推斷出肝移植后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞損傷來(lái)源。
揭示移植物損傷的早期標(biāo)志：WGBS技術(shù)使研究者能夠精確地識(shí)別cfDNA片段來(lái)源，并將其與移植物損傷的不同類型聯(lián)系起來(lái)。同時(shí)能夠提前檢測(cè)到移植物損傷信號(hào)，為早期診斷和干預(yù)提供了可能。
參考文獻(xiàn)：
McNamara, M.E., Jain, S.S., Oza, K. et al. Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant. Nat Commun 16, 5310 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60507-9
標(biāo)題：Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant（cfDNA甲基化模式揭示肝臟移植后同種異體移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源）
發(fā)表時(shí)間：2025年06月17日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術(shù)平臺(tái)：cfWGBS（易基因金牌技術(shù)）
移植后的并發(fā)癥會(huì)降低同種異體移植物和受者的存活率。目前用于非侵入性檢測(cè)移植器官損傷的方法有限，且無(wú)法區(qū)分細(xì)胞機(jī)制。本研究通過(guò)分析肝臟移植后由死亡細(xì)胞釋放到循環(huán)細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）片段，來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞損傷。研究分析了44名患者在移植后不同時(shí)間點(diǎn)采集的130份血液樣本。將基于序列的cfDNA片段甲基化模式比對(duì)到一個(gè)由476個(gè)純化細(xì)胞的甲基化組（methylomes）來(lái)源細(xì)胞類型特異性（cell-type-specific）DNA甲基化模式圖譜中。肝臟細(xì)胞類型的DNA甲基化模式和多組學(xué)數(shù)據(jù)綜合分析表明在開放染色質(zhì)和功能重要的調(diào)控區(qū)域有顯著富集。在沒(méi)有移植器官損傷的患者中，多組織細(xì)胞損傷在術(shù)后第一周內(nèi)恢復(fù)。然而，如果在術(shù)后第一個(gè)月內(nèi)持續(xù)檢測(cè)到肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA升高，則表明存在早期移植器官損傷。此外，cfDNA組成變化可以區(qū)分移植器官損傷的不同原因，顯示出非侵入性監(jiān)測(cè)和干預(yù)的潛力。
易小結(jié)
本研究提供了一種新的非侵入性方法，通過(guò)分析血液中的cfDNA甲基化模式來(lái)監(jiān)測(cè)肝臟移植后的移植物損傷。這種方法不僅可以早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，還可以區(qū)分損傷的不同原因，為臨床醫(yī)生提供了一種新的工具，以更精準(zhǔn)地監(jiān)測(cè)和干預(yù)肝臟移植后的并發(fā)癥。此外，該方法還能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)其他器官的損傷，如腎臟、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)，為多器官移植后的全面監(jiān)測(cè)提供了可能。
（詳見→深度綜述：cfDNA甲基化在器官和組織損傷檢測(cè)中的強(qiáng)大力量）
cfWGBS技術(shù)在本研究中不僅提供了單堿基分辨率的DNA甲基化信息，還通過(guò)多組學(xué)數(shù)據(jù)整合和片段反卷積分析，精確追溯cfDNA細(xì)胞來(lái)源，并揭示移植物損傷的早期標(biāo)志。這種方法為非侵入性監(jiān)測(cè)器官移植后的細(xì)胞損傷提供了一種新的、有效的手段，具有重要的臨床應(yīng)用前景。
研究方法
- 樣本收集：從44名肝臟移植患者中收集了130份血液樣本，包括術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后7天和30天的圍移植期。樣本分為兩組，一組是28名成年肝臟移植患者在圍移植期的樣本（100份），另一組是16名患者在因并發(fā)癥接受肝活檢時(shí)的樣本（30份）。
- cfDNA甲基化分析：提取cfDNA，并通過(guò)亞硫酸鹽處理后進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序（cfWGBS）。將cfDNA甲基化模式與476個(gè)純化細(xì)胞的細(xì)胞類型特異性DNA甲基化模式圖譜進(jìn)行比對(duì)，擴(kuò)展了現(xiàn)有的細(xì)胞類型特異性DNA甲基化圖譜，包括肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，如肝星狀細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、肝駐留免疫細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。
- 多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析：整合DNA甲基化模式和多組學(xué)數(shù)據(jù)，包括染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）和組蛋白修飾（H3K27ac）數(shù)據(jù)，驗(yàn)證甲基化模式與細(xì)胞功能和身份的相關(guān)性，揭示肝臟細(xì)胞類型的甲基化模式在開放染色質(zhì)和功能重要的調(diào)控區(qū)域有顯著富集。。
- 片段化反卷積分析（fragment-level deconvolution）：對(duì)cfDNA樣本進(jìn)行反卷積分析，估計(jì)不同細(xì)胞類型的相對(duì)貢獻(xiàn)。
結(jié)果圖形
1. 肝臟移植后cfDNA甲基化模式提示的細(xì)胞損傷
為監(jiān)測(cè)肝臟移植后的細(xì)胞損傷，研究團(tuán)隊(duì)28名成年肝臟移植患者中的圍移植期收集連續(xù)血液樣本，并在移植后至多一個(gè)月的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣本進(jìn)行了cfDNA甲基化分析（n=100份樣本）。還從出現(xiàn)并發(fā)癥的患者身上收集了樣本，并在因臨床指征進(jìn)行肝活檢（for-cause liver biopsy, FC-bx）以鑒定移植物損傷時(shí)，收集16名患者的匹配表型樣本（n=30份樣本）。從這130份樣本中分離出cfDNA片段經(jīng)亞硫酸鹽處理，通過(guò)WGBS測(cè)序分析將cfDNA片段化組織和細(xì)胞類型來(lái)源比對(duì)到擴(kuò)展型細(xì)胞類型特異性DNA甲基化圖譜中，來(lái)推斷組織損傷并區(qū)分移植物損傷的不同原因（圖1）。
研究結(jié)果表明，肝臟移植后cfDNA濃度顯著增加，主要來(lái)源于肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞類型的cfDNA增加與手術(shù)過(guò)程中的細(xì)胞損傷相關(guān)。此外還檢測(cè)到神經(jīng)元和心肌細(xì)胞cfDNA的增加，表明移植手術(shù)可能對(duì)多個(gè)器官造成損傷。
圖1：使用血液中的cfDNA甲基化模式監(jiān)測(cè)肝臟移植后的細(xì)胞損傷研究概述。
- 從健康組織中純化細(xì)胞的476個(gè)甲基化組參考數(shù)據(jù)中鑒定出細(xì)胞類型特異性的DNA甲基化模式。這些甲基化模式經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在染色質(zhì)開放性和功能重要的調(diào)控區(qū)域表現(xiàn)出顯著富集，隨后被用于追蹤患者cfDNA片段來(lái)源。
- 第一個(gè)月內(nèi)從28名患者在肝臟移植前后按照預(yù)定時(shí)間點(diǎn)收集連續(xù)血清樣本（n=100份樣本）。此外，還在16名患者的肝活檢證實(shí)的移植物損傷時(shí)收集血清樣本（n=30份樣本）。通過(guò)亞硫酸鹽處理后的cfDNA進(jìn)行cfDNA甲基化分析（cfWGBS）。
- 對(duì)移植器官以及其他受者器官的細(xì)胞損傷進(jìn)行定量檢測(cè)，以監(jiān)測(cè)全身范圍的影響。
2. 擴(kuò)展健康組織的基于測(cè)序DNA甲基化圖譜以表征肝細(xì)胞類型特異性表觀基因組
研究團(tuán)隊(duì)擴(kuò)展了現(xiàn)有的DNA甲基化圖譜，包括肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞類型，如肝星狀細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和肝駐留免疫細(xì)胞。通過(guò)全基因組甲基化測(cè)序（WGBS），生成了這些細(xì)胞類型的甲基化圖譜，為后續(xù)分析提供參考。
圖2：與其他健康組織相比的肝細(xì)胞類型DNA甲基化圖譜。
- 健康人細(xì)胞類型的參考全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）數(shù)據(jù)中鑒定的差異甲基化、細(xì)胞類型特異性甲基化區(qū)域（DMBs）熱圖。圖中的每個(gè)單元格標(biāo)記了20種細(xì)胞類型（列）中每種基因組區(qū)域（行）的甲基化評(píng)分，每種細(xì)胞類型最多顯示50個(gè)區(qū)域。
- 突出顯示排名前25的肝細(xì)胞特異性DMBs熱圖。
- 一個(gè)肝細(xì)胞特異性的低甲基化區(qū)域示例（以藍(lán)色突出顯示），位于在肝細(xì)胞中高表達(dá)的ECHS1基因上游（綠色軌跡）。來(lái)自UCSC基因組瀏覽器的比對(duì)顯示五種不同肝細(xì)胞類型以及PBMC樣本的WGBS樣本中平均DNA甲基化（DNAm，紫色軌跡）情況。還展示了肝細(xì)胞中的染色質(zhì)組織標(biāo)記（藍(lán)色軌跡），以顯示可及性（DNA酶I超敏感性，DHS）和調(diào)控功能（H3K27ac結(jié)合）。
- 五種不同肝細(xì)胞類型的參考WGBS樣本中，肝細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域的甲基化測(cè)序reads片段可視化。
研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞類型特異性的低甲基化區(qū)域與染色質(zhì)可及性和H3K27ac結(jié)合區(qū)域高度重合，表明這些區(qū)域在維持細(xì)胞類型特異性功能中具有重要作用。這些區(qū)域的甲基化模式可以作為細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。
圖3：肝細(xì)胞特異性低甲基化DNA區(qū)域與其他細(xì)胞特異性表觀遺傳標(biāo)記的重合。
a-b. 肝細(xì)胞類型特異性低甲基化區(qū)域與染色質(zhì)可及性及H3K27ac結(jié)合的關(guān)系。總結(jié)圖顯示圍繞每種肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞和肝免疫細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域的±5kb區(qū)域內(nèi)的DHS/ATAC-seq或H3K27ac標(biāo)記強(qiáng)度。c. 在相同細(xì)胞類型的chromHMM注釋中，與H3K4me1標(biāo)記相關(guān)標(biāo)記為增強(qiáng)子的細(xì)胞類型特異性低甲基化區(qū)域比例。
d. UCSC基因組瀏覽器比對(duì)顯示一個(gè)包含F(xiàn)OXA1結(jié)合序列的肝細(xì)胞特異性低甲基化區(qū)域。紫色軌跡顯示W(wǎng)GBS樣本的平均甲基化。
e. HOMER motif分析在肝細(xì)胞類型特異性低甲基化區(qū)域中富集先鋒（Pioneer）和發(fā)展（development）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。肝細(xì)胞的DHS、H3K27ac和H3K4me1數(shù)據(jù)來(lái)自德國(guó)表觀基因組計(jì)劃（DEEP）。肝細(xì)胞的FOXA1 ChIP-seq數(shù)據(jù)來(lái)自ENCODE項(xiàng)目。膽管上皮細(xì)胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)和肝星狀細(xì)胞的H3K27ac組蛋白修飾數(shù)據(jù)來(lái)自ENCODE項(xiàng)目。
4. 先鋒轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）在肝細(xì)胞類型特異性DNA甲基化區(qū)域富集
通過(guò)motif分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞類型特異性的DNA甲基化區(qū)域富含先鋒轉(zhuǎn)錄因子（如FOXA1/2、PAX7等）的結(jié)合位點(diǎn)。這些轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞發(fā)育和命運(yùn)決定中起關(guān)鍵作用，其結(jié)合位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)可能影響基因表達(dá)（圖3d、e）。
5. 肝臟移植后立即出現(xiàn)的細(xì)胞損傷來(lái)源
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分析肝臟移植后立即采集的血液樣本，發(fā)現(xiàn)cfDNA的主要來(lái)源是肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。這些細(xì)胞類型的cfDNA增加與手術(shù)過(guò)程中的細(xì)胞損傷相關(guān)。此外，還檢測(cè)到神經(jīng)元和心肌細(xì)胞cfDNA的增加，表明移植手術(shù)可能對(duì)多個(gè)器官造成損傷。
圖4：基于cfDNA片段甲基化模式推斷肝移植后細(xì)胞損傷來(lái)源。
- 從28名肝移植患者身上收集的術(shù)前和術(shù)后即刻（術(shù)后第0天，POD0）的連續(xù)血清樣本。
- cfDNA細(xì)胞來(lái)源的平均估計(jì)值。
- 肝細(xì)胞來(lái)源的cfDNA與AST和ALT酶活性的相關(guān)性（Spearman相關(guān)系數(shù)分別為r = 0.81，AST；r = 0.82，ALT；雙側(cè)檢驗(yàn)，p = 0.0021，AST；p = 0.004，ALT）。
6. 肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA的持續(xù)升高表明移植物損傷
研究發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第一個(gè)月內(nèi)，持續(xù)檢測(cè)到肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞cfDNA的升高與移植物損傷相關(guān)。這些cfDNA升高可以作為早期診斷移植物損傷的非侵入性標(biāo)志物。
圖5：肝移植后細(xì)胞類型特異性損傷的時(shí)間進(jìn)程。
- 從20名肝移植患者身上收集的術(shù)前、再灌注后（術(shù)后第0天，POD0）、術(shù)后第7天和第30天（POD7，POD30）的連續(xù)血清樣本。
- 移植物損傷的病因。在移植后1年內(nèi)，20名患者中有11名通過(guò)因臨床指征進(jìn)行的肝活檢被診斷出不同病因的移植物損傷。
- 肝細(xì)胞cfDNA在有移植物損傷（右側(cè)，n=11名患者）和無(wú)移植物損傷（左側(cè)，n=9名患者）的患者中的時(shí)間進(jìn)程。
- 各個(gè)體在POD7和POD30時(shí)的平均合并肝細(xì)胞cfDNA，按結(jié)果分組（移植物損傷 n=11名患者，無(wú)移植物損傷n=9名患者）。
- 膽管cfDNA在有移植物損傷（右側(cè)，n=11名患者）和無(wú)移植物損傷（左側(cè)，n=9名患者）的患者中的時(shí)間進(jìn)程。
- 各個(gè)體在POD7和POD30時(shí)的平均合并膽管cfDNA，按結(jié)果分組（移植物損傷11名患者，無(wú)移植物損傷9名患者）。
- 在有移植物損傷（右側(cè)，n = 11）和無(wú)移植物損傷（左側(cè)，n = 9）的患者中，五種肝細(xì)胞類型cfDNA的時(shí)間進(jìn)程。
7. 細(xì)胞游離cfDNA甲基化追溯移植物損傷來(lái)源
通過(guò)分析cfDNA的甲基化模式，研究團(tuán)隊(duì)能夠區(qū)分肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞來(lái)源的損傷，從而確定移植物損傷的具體類型。這種方法可以為臨床醫(yī)生提供更精準(zhǔn)的診斷工具，減少對(duì)侵入性活檢的依賴。
圖6：cfDNA甲基化模式提示移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源。
- 在因臨床指征進(jìn)行肝活檢（FC-bx）時(shí)收集的血清樣本，用于診斷移植物損傷。所有活檢均在肝移植后1年內(nèi)進(jìn)行，樣本代表了24名患者（n=30份樣本）。
- 根據(jù)活檢中觀察到的損傷模式對(duì)cfDNA的細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行分類。上方顯示了每種移植物損傷類型檢測(cè)到的不同細(xì)胞來(lái)源的平均比例。下方是列聯(lián)堆疊條形圖，展示每個(gè)個(gè)體樣本中實(shí)體器官細(xì)胞基因組當(dāng)量（Geq）比例，其中每個(gè)堆疊代表一個(gè)不同的樣本，堆疊中每個(gè)段落高度代表該細(xì)胞類型組在樣本中的相對(duì)cfDNA比例。
- 在有肝細(xì)胞或混合肝膽損傷的血清樣本中，與單純的膽管損傷相比，肝細(xì)胞cfDNA水平。
- 在有膽管或混合肝膽損傷的血清樣本中，與單純的肝細(xì)胞損傷相比，膽管cfDNA水平。（b–d 血清樣本被分類為n=14份肝細(xì)胞損傷，n=10份混合肝膽損傷，n=6份膽管損傷的移植物損傷病因）
討論和啟示
本研究結(jié)果表明，cfDNA甲基化模式可以作為非侵入性監(jiān)測(cè)肝移植后移植物損傷的有力工具。通過(guò)擴(kuò)展的DNA甲基化圖譜和多組學(xué)數(shù)據(jù)整合，研究團(tuán)隊(duì)不僅能夠早期發(fā)現(xiàn)移植物損傷，還可以區(qū)分損傷的不同原因，為臨床醫(yī)生提供了更精準(zhǔn)的診斷工具。此外，該方法還可以同時(shí)監(jiān)測(cè)其他器官的損傷，為多器官移植后的全面監(jiān)測(cè)提供了可能。
cfWGBS在本研究中的作用
生成細(xì)胞類型特異性的DNA甲基化圖譜：研究團(tuán)隊(duì)利用WGBS技術(shù)生成多種肝細(xì)胞類型（包括肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝內(nèi)皮細(xì)胞）的單堿基分辨率DNA甲基化圖譜。使研究者能夠精確地識(shí)別和量化不同細(xì)胞類型中的甲基化狀態(tài)。這對(duì)于區(qū)分不同細(xì)胞來(lái)源的cfDNA片段至關(guān)重要。
驗(yàn)證甲基化模式與細(xì)胞功能的相關(guān)性：通過(guò)將WGBS數(shù)據(jù)與染色質(zhì)可及性（ATAC-seq）和組蛋白修飾（H3K27ac）數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了肝細(xì)胞類型特異性的低甲基化區(qū)域與染色質(zhì)可及性和功能重要的調(diào)控區(qū)域的重合。這些區(qū)域在維持細(xì)胞類型特異性功能中具有重要作用。
追溯cfDNA的細(xì)胞來(lái)源：研究團(tuán)隊(duì)利用WGBS生成的甲基化圖譜，通過(guò)片段反卷積分析推斷cfDNA片段的細(xì)胞來(lái)源。這種方法能夠精確地識(shí)別cfDNA片段的組織和細(xì)胞類型，從而推斷出肝移植后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞損傷來(lái)源。
揭示移植物損傷的早期標(biāo)志：WGBS技術(shù)使研究者能夠精確地識(shí)別cfDNA片段來(lái)源，并將其與移植物損傷的不同類型聯(lián)系起來(lái)。同時(shí)能夠提前檢測(cè)到移植物損傷信號(hào)，為早期診斷和干預(yù)提供了可能。
參考文獻(xiàn)：
McNamara, M.E., Jain, S.S., Oza, K. et al. Circulating cell-free DNA methylation patterns indicate cellular sources of allograft injury after liver transplant. Nat Commun 16, 5310 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60507-9
標(biāo)簽：
DNA甲基化
- cfDNA甲基化模式追溯肝臟移植后同種異體移植物損傷的細(xì)胞來(lái)源
- 微量WGBS等揭示有袋類和真獸類動(dòng)物胚胎中DNA甲基化動(dòng)態(tài)差異
- ChIP-seq助力揭示AcP依賴性乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)對(duì)放線菌穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制
- ChIP-seq揭示組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2在炎癥性腸病發(fā)生過(guò)程中的表觀調(diào)控
- 微量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示TET酶在動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟和孤雌胚胎發(fā)育中的作用
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