ChIP-seq助力揭示AcP依賴性乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)對放線菌穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制
近日，華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院和生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室葉邦策教授和尤迪副教授為共同通訊作者、符瑜博士為第一作者在微生物學(xué)領(lǐng)域著名期刊《mBio》上發(fā)表題為《A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria》的科研成果。研究通過ChIP-seq等分析揭示乙酰磷酸（Acetyl Phosphate, AcP）依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)在放線菌（Actinobacteria）中調(diào)控環(huán)二腺苷酸單磷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）穩(wěn)態(tài)的分子機制。研究以紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）為模型，揭示AcP通過乙酰化修飾影響兩種關(guān)鍵蛋白：二腺苷酸環(huán)化酶（Diadenylate Cyclase, DisA）和其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR，從而調(diào)控c-di-AMP合成與降解，維持細胞內(nèi)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。其調(diào)控機制在放線菌中高度保守，并可能對細胞的生長、發(fā)育和抗生素合成產(chǎn)生重要影響。
標題：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依賴的修飾網(wǎng)絡(luò)調(diào)控放線菌中c-di-AMP穩(wěn)態(tài)）
發(fā)表時間：2024-07-09
發(fā)表期刊：mBio
影響因子：IF6.4/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq等
本研究提出一個由乙酰磷酸（AcP）調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)通過DisA和DasR這兩個不同的底物來負責(zé)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。研究揭示了AcP誘導(dǎo)的乙酰化通過破壞蛋白質(zhì)多聚體化來調(diào)控，從而通過DisA的K66位點乙酰化抑制c-di-AMP合成；而DasR的K78位點乙酰化則消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制。研究驗證了AcP通過介導(dǎo)平衡c-di-AMP穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵生理作用。進一步的研究表明，乙酰化的DisA和DasR發(fā)生了構(gòu)象變化，這些變化在分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鑒于AcP誘導(dǎo)的乙酰化在響應(yīng)環(huán)境脅迫時的廣泛分布以及所鑒定關(guān)鍵位點的高度保守性，研究人員提出c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控可能是放線菌中心回路的一個基本特性，從而實現(xiàn)對細胞生理的整體調(diào)控。
易小結(jié)
c-di-AMP是一種在細菌中廣泛存在的核苷酸第二信使，參與調(diào)控細胞壁完整性、滲透壓平衡、生物膜形成等多種生物學(xué)過程。易基因參與的前期研究揭示了c-di-AMP與紅色糖多孢菌（放線菌模式菌株）中GlcNAc信號之間的直接聯(lián)系，并闡明蛋白質(zhì)酰基化與c-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機制的研究進展。
詳見：
項目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細菌生長、發(fā)育和抗生素合成
項目文章 | NAR：ChIP-seq等揭示蛋白質(zhì)酰基化與c-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機制
本研究再次突破，通過ChIP-seq等分析揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)對c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制，為理解放線菌的生長發(fā)育、抗生素合成以及環(huán)境適應(yīng)機制提供了新視角，為開發(fā)新型抗菌藥物和優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株奠定理論基礎(chǔ)。
研究要點
c-di-AMP鑒定對于細菌生長和細胞生理是必需的，因此本研究的主要挑戰(zhàn)是細胞信號和刺激如何進入決定c-di-AMP濃度的決策過程，以及這些信息如何整合到調(diào)控通路中。研究以S. erythraea為模型驗證了AcP依賴的DisA乙酰化及其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR參與協(xié)調(diào)環(huán)境信號和細胞內(nèi)信號，這對于c-di-AMP穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。
具體而言，DisA的K66位點乙酰化直接失活其二腺苷酸環(huán)化酶活性，從而抑制c-di-AMP產(chǎn)生，而DasR的K78位點乙酰化則導(dǎo)致disA表達增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP維持中的一個關(guān)鍵分子開關(guān)，它響應(yīng)環(huán)境變化，可能抑制有效發(fā)育。因此，AcP介導(dǎo)的翻譯后修飾（PTM）構(gòu)成了合成酶/水解酶調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)。
乙酰磷酸（AcP）調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)通路示意圖
研究方法
蛋白質(zhì)乙酰化狀態(tài)檢測：通過免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）和免疫印跡（Immunoblotting, IB）分析檢測DisA和DasR的乙酰化水平。
體外乙酰化實驗：利用AcP對DisA和DasR進行體外乙酰化反應(yīng)，驗證其乙酰化位點。
質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）：鑒定乙酰化修飾的位點，確定DisA的K66和DasR的K78為關(guān)鍵乙酰化位點。
酶活性檢測：通過酶活性實驗檢測乙酰化對DisA二腺苷酸環(huán)化酶（DAC）活性的影響。
基因轉(zhuǎn)錄分析：利用實時定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
染色質(zhì)免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因組上的結(jié)合位點，驗證其對disA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
生物物理實驗：圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）分析、化學(xué)交聯(lián)實驗和生物層干涉（Biolayer Interferometry, BLI）實驗，研究乙酰化對蛋白結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合能力的影響。
細胞生理實驗：通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同突變株的發(fā)育表型。
結(jié)果圖形
（1）AcP依賴的乙酰化直接抑制DisA的DAC活性
研究發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，DisA乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DisA。體外實驗表明，乙酰化DisA的DAC活性降低約75%，表明AcP依賴的乙酰化顯著抑制了DisA的酶活性。進一步的質(zhì)譜分析鑒定出DisA的K66為關(guān)鍵乙酰化位點，位于其DAC結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該位點乙酰化導(dǎo)致DisA八聚體結(jié)構(gòu)解離，從而抑制其DAC活性，減少c-di-AMP合成。
圖1：AcP誘導(dǎo)的DisA乙酰化抑制其DAC活性。
(A) 在氮充足（N+）或氮限制（N-）條件下，S. erythraea野生型（WT）菌株的DisA乙酰化水平。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DisA蛋白進行不同時間點（0、1、3和5h）的乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DisA野生型（DisAWT）和乙酰化DisA（DisAAcP）蛋白的DAC活性。
(D) DisAWT和DisAAcP蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DisA的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DisAWT、DisAAcP、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的交聯(lián)實驗。
(G) DisAWT、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的DAC活性。
（2）DisA主要在K66位點乙酰化時失活
通過構(gòu)建DisA的K66突變體（K66Q和K66R），研究發(fā)現(xiàn)K66Q突變體的八聚體結(jié)構(gòu)顯著減少，DAC活性亦顯著降低，而K66R突變體表現(xiàn)出與野生型相似活性。這表明K66位點乙酰化是DisA失活的主要原因。此外，過表達DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平顯著降低，進一步驗證K66乙酰化對c-di-AMP合成的抑制作用。
圖2：K66乙酰化對體內(nèi)c-di-AMP合成的影響。
(A) S. erythraea野生型（WT）、過表達DisAWT（OdisAWT）、過表達DisAK66Q（OdisAK66Q）和過表達DisAK66R（OdisAK66R）菌株在30°C下TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長曲線。
(B) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株中disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
(C) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株的細胞提取物中細胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
（3）AcP依賴的乙酰化通過失活DasR消除對disA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
研究發(fā)現(xiàn)，DasR是disA基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而AcP能夠乙酰化DasR并影響其功能。在氮限制條件下，DasR乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DasR。乙酰化使DasR的DNA結(jié)合能力顯著減弱，從而消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致c-di-AMP水平升高。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DasR蛋白不同時間點（0、1、3和5h）乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）與目標基因disA啟動子的結(jié)合電泳遷移率變化分析（EMSA）。
(D) DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DasR的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DasR及其突變體與目標基因disA啟動子的結(jié)合EMSA分析。
(G) 純化的His-DasR、DasRAcP、DasRK78Q和DasRK78R與disA基因啟動子的結(jié)合BLI實驗。
(H) DasR及其突變體的交聯(lián)實驗。
（4）DasR的K78位點乙酰化促進disA轉(zhuǎn)錄和c-di-AMP合成
質(zhì)譜分析鑒定出DasR的K78為關(guān)鍵乙酰化位點。通過構(gòu)建DasR的K78突變體（K78Q和K78R），研究發(fā)現(xiàn)K78Q突變體的DNA結(jié)合能力顯著減弱，而K78R突變體則表現(xiàn)出與野生型相似的活性。ChIP-seq分析顯示，K78乙酰化顯著降低了DasR在disA啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，從而消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制，促進c-di-AMP的合成。
(B) 指定菌株中的ChIP-seq信號。
(C) 在指定菌株中，disA啟動子區(qū)域的ChIP-seq信號的整合基因組瀏覽器（IGV）軌跡。
(D) 指定菌株中disA的轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示與DasR野生型（DasRWT）菌株相比的表達水平。
(E) 指定菌株中細胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
（5）c-di-AMP穩(wěn)態(tài)介導(dǎo)多細胞分化
研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP水平變化對S. erythraea菌發(fā)育和孢子形成具有顯著影響。過表達DisAK66Q的菌株表現(xiàn)出延遲的孢子形成，而過表達DisAK66R菌株則表現(xiàn)出過度孢子形成。這表明c-di-AMP水平升高促進了孢子形成，而K66位點乙酰化則抑制這一過程。此外，DasR的K78乙酰化也通過調(diào)控c-di-AMP水平影響孢子形成。
（6）AcP與c-di-AMP穩(wěn)態(tài)之間的生理聯(lián)系保守
通過序列比對分析，研究發(fā)現(xiàn)DisA的K66和DasR的K78位點在多種放線菌中高度保守。這表明AcP依賴的乙酰化調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的機制在放線菌中具有廣泛的保守性，可能對放線菌的生長發(fā)育和抗生素合成具有普遍的調(diào)控作用。
圖6：放線菌中DasR和DisA蛋白的序列比對。
對以下物種的DisA（A）和DasR（B）蛋白序列進行了比對：青鏈霉菌（Streptomyces lividans）、天藍色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）、阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）、灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）、紅孢鏈霉菌（Streptosporangium roseum）、熱單胞菌（Thermomonospora curvata）以及紅色糖多孢菌（S. erythraea）。所有物種中保守的賴氨酸殘基以紅色加粗顯示。
討論
本研究揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)在調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)中的重要作用。AcP通過乙酰化修飾DisA和DasR，直接或間接調(diào)控c-di-AMP的合成與降解。這種調(diào)控機制不僅在紅色糖多孢菌中存在，還在其他放線菌中具有廣泛的保守性。此外，c-di-AMP水平的變化對細菌的生長發(fā)育和抗生素合成具有顯著影響，表明c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控對于放線菌的生理功能至關(guān)重要。未來的研究可以進一步探索AcP依賴的乙酰化修飾在其他細菌中的作用機制，以及如何通過調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)來優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究通過ChIP-seq分析，研究者精確地定位DasR在基因組上的結(jié)合位點，驗證了DasR對disA基因的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，ChIP-seq數(shù)據(jù)還揭示了AcP依賴的乙酰化如何通過影響DasR的DNA結(jié)合能力來調(diào)控c-di-AMP合成，為研究c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的分子機制提供重要依據(jù)。
參考文獻：
Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.
標題：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依賴的修飾網(wǎng)絡(luò)調(diào)控放線菌中c-di-AMP穩(wěn)態(tài)）
發(fā)表期刊：mBio
影響因子：IF6.4/Q1
技術(shù)平臺：ChIP-seq等
本研究提出一個由乙酰磷酸（AcP）調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)通過DisA和DasR這兩個不同的底物來負責(zé)c-di-AMP穩(wěn)態(tài)。研究揭示了AcP誘導(dǎo)的乙酰化通過破壞蛋白質(zhì)多聚體化來調(diào)控，從而通過DisA的K66位點乙酰化抑制c-di-AMP合成；而DasR的K78位點乙酰化則消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制。研究驗證了AcP通過介導(dǎo)平衡c-di-AMP穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵生理作用。進一步的研究表明，乙酰化的DisA和DasR發(fā)生了構(gòu)象變化，這些變化在分化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。鑒于AcP誘導(dǎo)的乙酰化在響應(yīng)環(huán)境脅迫時的廣泛分布以及所鑒定關(guān)鍵位點的高度保守性，研究人員提出c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控可能是放線菌中心回路的一個基本特性，從而實現(xiàn)對細胞生理的整體調(diào)控。
易小結(jié)
c-di-AMP是一種在細菌中廣泛存在的核苷酸第二信使，參與調(diào)控細胞壁完整性、滲透壓平衡、生物膜形成等多種生物學(xué)過程。易基因參與的前期研究揭示了c-di-AMP與紅色糖多孢菌（放線菌模式菌株）中GlcNAc信號之間的直接聯(lián)系，并闡明蛋白質(zhì)酰基化與c-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機制的研究進展。
詳見：
項目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細菌生長、發(fā)育和抗生素合成
項目文章 | NAR：ChIP-seq等揭示蛋白質(zhì)酰基化與c-di-GMP協(xié)同調(diào)控放線菌發(fā)育與抗生素合成機制
本研究再次突破，通過ChIP-seq等分析揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)對c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機制，為理解放線菌的生長發(fā)育、抗生素合成以及環(huán)境適應(yīng)機制提供了新視角，為開發(fā)新型抗菌藥物和優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株奠定理論基礎(chǔ)。
研究要點
c-di-AMP鑒定對于細菌生長和細胞生理是必需的，因此本研究的主要挑戰(zhàn)是細胞信號和刺激如何進入決定c-di-AMP濃度的決策過程，以及這些信息如何整合到調(diào)控通路中。研究以S. erythraea為模型驗證了AcP依賴的DisA乙酰化及其轉(zhuǎn)錄抑制因子DasR參與協(xié)調(diào)環(huán)境信號和細胞內(nèi)信號，這對于c-di-AMP穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。
具體而言，DisA的K66位點乙酰化直接失活其二腺苷酸環(huán)化酶活性，從而抑制c-di-AMP產(chǎn)生，而DasR的K78位點乙酰化則導(dǎo)致disA表達增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP維持中的一個關(guān)鍵分子開關(guān)，它響應(yīng)環(huán)境變化，可能抑制有效發(fā)育。因此，AcP介導(dǎo)的翻譯后修飾（PTM）構(gòu)成了合成酶/水解酶調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)。
乙酰磷酸（AcP）調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)通路示意圖
研究方法
蛋白質(zhì)乙酰化狀態(tài)檢測：通過免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）和免疫印跡（Immunoblotting, IB）分析檢測DisA和DasR的乙酰化水平。
體外乙酰化實驗：利用AcP對DisA和DasR進行體外乙酰化反應(yīng)，驗證其乙酰化位點。
質(zhì)譜分析（LC-MS/MS）：鑒定乙酰化修飾的位點，確定DisA的K66和DasR的K78為關(guān)鍵乙酰化位點。
酶活性檢測：通過酶活性實驗檢測乙酰化對DisA二腺苷酸環(huán)化酶（DAC）活性的影響。
基因轉(zhuǎn)錄分析：利用實時定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）檢測disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
染色質(zhì)免疫沉淀測序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因組上的結(jié)合位點，驗證其對disA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
生物物理實驗：圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）分析、化學(xué)交聯(lián)實驗和生物層干涉（Biolayer Interferometry, BLI）實驗，研究乙酰化對蛋白結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合能力的影響。
細胞生理實驗：通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察不同突變株的發(fā)育表型。
結(jié)果圖形
（1）AcP依賴的乙酰化直接抑制DisA的DAC活性
研究發(fā)現(xiàn)，在氮限制條件下，DisA乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DisA。體外實驗表明，乙酰化DisA的DAC活性降低約75%，表明AcP依賴的乙酰化顯著抑制了DisA的酶活性。進一步的質(zhì)譜分析鑒定出DisA的K66為關(guān)鍵乙酰化位點，位于其DAC結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該位點乙酰化導(dǎo)致DisA八聚體結(jié)構(gòu)解離，從而抑制其DAC活性，減少c-di-AMP合成。
圖1：AcP誘導(dǎo)的DisA乙酰化抑制其DAC活性。
(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DisA蛋白進行不同時間點（0、1、3和5h）的乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DisA野生型（DisAWT）和乙酰化DisA（DisAAcP）蛋白的DAC活性。
(D) DisAWT和DisAAcP蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DisA的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DisAWT、DisAAcP、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的交聯(lián)實驗。
(G) DisAWT、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的DAC活性。
（2）DisA主要在K66位點乙酰化時失活
通過構(gòu)建DisA的K66突變體（K66Q和K66R），研究發(fā)現(xiàn)K66Q突變體的八聚體結(jié)構(gòu)顯著減少，DAC活性亦顯著降低，而K66R突變體表現(xiàn)出與野生型相似活性。這表明K66位點乙酰化是DisA失活的主要原因。此外，過表達DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平顯著降低，進一步驗證K66乙酰化對c-di-AMP合成的抑制作用。
圖2：K66乙酰化對體內(nèi)c-di-AMP合成的影響。
(B) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株中disA基因的轉(zhuǎn)錄水平。
(C) 在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株的細胞提取物中細胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
（3）AcP依賴的乙酰化通過失活DasR消除對disA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
研究發(fā)現(xiàn)，DasR是disA基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子，而AcP能夠乙酰化DasR并影響其功能。在氮限制條件下，DasR乙酰化水平顯著升高，且AcP能夠直接乙酰化DasR。乙酰化使DasR的DNA結(jié)合能力顯著減弱，從而消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致c-di-AMP水平升高。
圖3：AcP誘導(dǎo)的DasR乙酰化阻斷其DNA結(jié)合活性。
(A) 在氮充足（N+）或氮限制（N-）條件下，S. erythraea WT菌株中DasR乙酰化水平。(B) 在37°C下，使用10 mM AcP對His標簽的DasR蛋白不同時間點（0、1、3和5h）乙酰化處理。通過Western blotting使用特異性抗乙酰賴氨酸（anti-AcK）抗體檢測乙酰化水平。
(C) DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）與目標基因disA啟動子的結(jié)合電泳遷移率變化分析（EMSA）。
(D) DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）蛋白的圓二色光譜（CD）圖。
(E) DasR的結(jié)構(gòu)域組織以不同顏色的方框表示。
(F) DasR及其突變體與目標基因disA啟動子的結(jié)合EMSA分析。
(G) 純化的His-DasR、DasRAcP、DasRK78Q和DasRK78R與disA基因啟動子的結(jié)合BLI實驗。
(H) DasR及其突變體的交聯(lián)實驗。
（4）DasR的K78位點乙酰化促進disA轉(zhuǎn)錄和c-di-AMP合成
質(zhì)譜分析鑒定出DasR的K78為關(guān)鍵乙酰化位點。通過構(gòu)建DasR的K78突變體（K78Q和K78R），研究發(fā)現(xiàn)K78Q突變體的DNA結(jié)合能力顯著減弱，而K78R突變體則表現(xiàn)出與野生型相似的活性。ChIP-seq分析顯示，K78乙酰化顯著降低了DasR在disA啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，從而消除對disA的轉(zhuǎn)錄抑制，促進c-di-AMP的合成。
圖4：K78乙酰化在體內(nèi)消除DasR介導(dǎo)的對disA的抑制作用。
(A) ChIP-seq信號密度在peaks中心和轉(zhuǎn)錄起始位點（±2 kb）熱圖。顯示了平均信號強度。紅色表示信號強度低，藍色表示信號強度高。(B) 指定菌株中的ChIP-seq信號。
(C) 在指定菌株中，disA啟動子區(qū)域的ChIP-seq信號的整合基因組瀏覽器（IGV）軌跡。
(D) 指定菌株中disA的轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示與DasR野生型（DasRWT）菌株相比的表達水平。
(E) 指定菌株中細胞內(nèi)的c-di-AMP水平。
（5）c-di-AMP穩(wěn)態(tài)介導(dǎo)多細胞分化
研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP水平變化對S. erythraea菌發(fā)育和孢子形成具有顯著影響。過表達DisAK66Q的菌株表現(xiàn)出延遲的孢子形成，而過表達DisAK66R菌株則表現(xiàn)出過度孢子形成。這表明c-di-AMP水平升高促進了孢子形成，而K66位點乙酰化則抑制這一過程。此外，DasR的K78乙酰化也通過調(diào)控c-di-AMP水平影響孢子形成。
圖5：AcP誘導(dǎo)的乙酰化影響孢子形成。
S. erythraea野生型（WT）、過表達DisAK66Q（OdisAK66Q）、過表達DisAK66R（OdisAK66R）、過表達DasRK78Q（OdasRK78Q）和過表達DasRK78R（OdasRK78R）菌株在30°C下于R2YE agar上培養(yǎng)96小時后的掃描電子顯微照片。圖像放大倍數(shù)為×5000。兩次重復(fù)實驗中結(jié)果相似的代表性圖片。（6）AcP與c-di-AMP穩(wěn)態(tài)之間的生理聯(lián)系保守
通過序列比對分析，研究發(fā)現(xiàn)DisA的K66和DasR的K78位點在多種放線菌中高度保守。這表明AcP依賴的乙酰化調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的機制在放線菌中具有廣泛的保守性，可能對放線菌的生長發(fā)育和抗生素合成具有普遍的調(diào)控作用。
圖6：放線菌中DasR和DisA蛋白的序列比對。
討論
本研究揭示了AcP依賴的乙酰化修飾網(wǎng)絡(luò)在調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)中的重要作用。AcP通過乙酰化修飾DisA和DasR，直接或間接調(diào)控c-di-AMP的合成與降解。這種調(diào)控機制不僅在紅色糖多孢菌中存在，還在其他放線菌中具有廣泛的保守性。此外，c-di-AMP水平的變化對細菌的生長發(fā)育和抗生素合成具有顯著影響，表明c-di-AMP穩(wěn)態(tài)調(diào)控對于放線菌的生理功能至關(guān)重要。未來的研究可以進一步探索AcP依賴的乙酰化修飾在其他細菌中的作用機制，以及如何通過調(diào)控c-di-AMP穩(wěn)態(tài)來優(yōu)化抗生素生產(chǎn)菌株。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究通過ChIP-seq分析，研究者精確地定位DasR在基因組上的結(jié)合位點，驗證了DasR對disA基因的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，ChIP-seq數(shù)據(jù)還揭示了AcP依賴的乙酰化如何通過影響DasR的DNA結(jié)合能力來調(diào)控c-di-AMP合成，為研究c-di-AMP穩(wěn)態(tài)的分子機制提供重要依據(jù)。
參考文獻：
Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.
標簽：
ChIP-seq
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