上一期我們給大家介紹了Cre-lox系統的基本原理，不知道大家有沒有理解呢？點擊查看：小鼠大學問 | Cre-Lox系統核心原理全解析

本期我們給大家帶來了Cre-lox系統的一些常見問題。幫助大家更好的利用Cre-lox系統進行研究。

Cre小鼠的建立方法對Cre表達的影響

早期構建Cre小鼠主要采用隨機轉基因技術。具體而言，是將帶有外源特異性啟動子的Cre基因序列隨機整合到小鼠基因組的某個位置。然而，采用這種方法得到的轉基因小鼠，其整合位點和基因拷貝數均不可控。由于整合位置的隨機性，Cre重組酶的表達可能會受到染色體狀態的干擾，例如，DNA甲基化等表觀遺傳修飾可能會導致Cre基因的沉默，進而影響Cre重組酶的正常表達。

因此，更為可靠的方法是通過基因打靶（ES細胞或CRISPR/Cas9途徑）的方式將單拷貝的Cre基因定點整合到內源基因座中。主要有以下兩種：
（1）取代型表達Cre表達框直接插入到內源基因起始密碼子前；
（2）共表達型的構建方式是將Cre表達框通過2A（自剪切多肽）或IRES（內部核糖體進入位點序列）元件敲入到小鼠內源基因的3'端。
 

圖1. 取代型表達

圖2. 共表達

如何測試一個新的Cre小鼠品系

通常我們會利用Reporter小鼠與Cre小鼠雜交來驗證Cre的表達譜。Reporter小鼠一般是在Rosa26位點插入了帶有lox-stop-lox終止盒以及緊隨其后的報告基因。在沒有Cre酶存在的情況下，報告基因不會表達。當與Cre小鼠雜交后，Cre酶會識別并切除lox-stop-lox終止盒，使報告基因得以表達，通過觀察報告基因的表達情況，可推斷出Cre酶的活性及其作用范圍。

圖3. 共表達^[1]

Cre重組酶的意外表達

通常，我們希望Cre重組酶僅在特定組織/細胞中發揮作用，但其意外表達（即“異位”表達）仍然可能發生，這可能導致非預期的重組事件發生。因此，在構建Cre小鼠模型時，選擇高特異性的Marker基因至關重要。這些基因可以高效、精確地驅動Cre表達，從而降低漏表達或異位表達的風險。應盡量避免使用高表達但非特異的Marker基因，以減少實驗誤差。

在使用Reporter小鼠驗證組織特異性Cre小鼠時，常常會發現報告基因的表達比預期的更為廣泛。為確認是否發生了生殖系中的Cre意外表達，可通過將不同性別的子代小鼠（Cre/+; flox/+）分別與野生型小鼠交配，以獲得第二代子代。如果第二代小鼠的報告基因表達范圍顯著擴大，這表明很有可能發生了Cre的生殖系表達。因為Cre介導的重組可能發生在配子形成的二倍體階段，從而導致后代即使未攜帶Cre，仍表現出報告基因的表達。

若Cre小鼠發生生殖系表達，使用該Cre小鼠進行條件性基因打靶時，需謹慎選擇性別和交配方式。例如，母系遺傳的Cre小鼠品系應使用雄性Cre陽性小鼠進行繁育，而父系遺傳的Cre小鼠品系則需使用雌性Cre陽性小鼠進行繁育。此外，誘導型Cre小鼠是一種有效的解決方案，通過僅在成年期或胚胎發育晚期激活Cre重組活性，可避免生殖系的意外表達，從而獲得更可靠的條件性基因打靶模型。
 

條件性敲除小鼠的繁育策略

cKO小鼠通常需要把兩個等位基因全部刪除，才能達到基因敲除的目的，故其flox等位基因的基因型應該為純合。一般情況下，Cre工具鼠一般是半合子/雜合子。（保證cre基因的拷貝數一致，避免重組效率不同導致實驗可重復性差；Cre小鼠的構建方式為轉基因隨機插入或取代型敲入時，可能會破壞內源基因的表達，使用半合子/雜合子在一定程度上可以避免該影響。）由此可見，cKO小鼠的目標基因型一般是cre/+；flox/flox。（此處+代表wildtype）
 

圖4. 條件性敲除小鼠的繁育策略
 

首先，將Cre雜合子小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得的Cre與flox雙陽性（Cre/+; flox/+）子代小鼠。之后，再將Cre與flox雙陽性（Cre/+; flox/+）子代小鼠與flox雜合子或純合子小鼠交配，獲得所需的cre/+；flox/flox小鼠為實驗組。一般對照組為同窩+/+；flox/flox小鼠。

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References
[1]. Duffield JS, Humphreys BD. Origin of new cells in the adult kidney: results from genetic labeling techniques. Kidney Int. 2011 Mar;79(5):494-501. doi: 10.1038/ki.2010.338. Epub 2010 Sep 22. PMID: 20861816.

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