上期講述的單重組酶報(bào)告基因系統(tǒng)只能依賴一個(gè) Maker 來(lái)定位我們的目的細(xì)胞，如果沒有特定細(xì)胞類型特有的基因，則無(wú)法通過(guò)常規(guī)方法對(duì)其進(jìn)行特異性標(biāo)記。

往期推文：
【譜系示蹤系列第一期】基礎(chǔ)細(xì)胞標(biāo)記方式
【譜系示蹤系列第二期】單重組酶介導(dǎo)的多色報(bào)告系統(tǒng)方法

但隨著細(xì)胞分類的不斷深入，我們往往需要兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的 Maker 才能準(zhǔn)確定位我們想要研究的細(xì)胞群體，并且在一個(gè)細(xì)胞群中靶向兩個(gè)基因啟動(dòng)子可能比依賴傳統(tǒng)報(bào)告系統(tǒng)中常用的單個(gè)啟動(dòng)子更精確。這時(shí)標(biāo)記細(xì)胞就需要使用到多重組酶介導(dǎo)的遺傳方法。

控制由兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的受限制報(bào)告基因表達(dá)需要兩種不同的重組酶系統(tǒng)，例如 Cre-loxP、Flp-frt、Dre-rox 和 Nigri-nox 等。目前已經(jīng)開發(fā)了多種雙重組酶介導(dǎo)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，以增強(qiáng)特異性和同時(shí)標(biāo)記的細(xì)胞類型數(shù)量，目前常見的可分為交叉報(bào)告基因類型、獨(dú)家報(bào)告基因類型和嵌套報(bào)告基因類型。

圖. 多重組酶介導(dǎo)的基因重組系統(tǒng)^[1]

本期鼠博士為大家講解多重組酶介導(dǎo)的交叉報(bào)告基因類型。

交叉報(bào)告基因系統(tǒng)
為了精確標(biāo)記一個(gè)細(xì)胞群，有時(shí)使用兩個(gè)細(xì)胞特異性 maker 來(lái)定義細(xì)胞群，例如細(xì)胞特異性 makerA 與細(xì)胞特異性 makerB 雙陽(yáng)性的細(xì)胞（簡(jiǎn)稱為A⁺B⁺ Cell）。如何使用合適的報(bào)告基因標(biāo)記系統(tǒng)，特異性標(biāo)記這類型細(xì)胞呢？這時(shí)就需要用到交叉報(bào)告基因系統(tǒng)。

交叉報(bào)告基因系統(tǒng)用于標(biāo)記兩個(gè) maker 雙陽(yáng)性的細(xì)胞類型，根據(jù)其標(biāo)記顏色也可分為單色報(bào)告系統(tǒng)與多色報(bào)告系統(tǒng)。

單色報(bào)告系統(tǒng)
交叉報(bào)告基因小鼠與細(xì)胞特異性 makerA 的 Cre 鼠、細(xì)胞特異性 makerB 的 Dre 鼠進(jìn)行交配。得到的小鼠體內(nèi)的兩個(gè) maker 雙陽(yáng)性的細(xì)胞被標(biāo)記為單色，其他細(xì)胞不被標(biāo)記上顏色。
 

1 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到stop序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

2 A⁺B^- 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到第二個(gè) stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

3 A^-B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（第二個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到第一個(gè) stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

4 A⁺B⁺ 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列被切除），makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（第二個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

因此，僅A⁺B⁺細(xì)胞可被標(biāo)記為紅色。

案例1
下圖中就是通過(guò)兩個(gè)細(xì)胞特異性標(biāo)記特異性標(biāo)記了細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞 （BASC）。BASC 是位于細(xì)支氣管肺泡管交界處的多能干細(xì)胞，它們共同表達(dá)細(xì)支氣管細(xì)胞標(biāo)志物 Scgb1a1（也稱為 CC10）和肺泡2型細(xì)胞標(biāo)志物 Sftpc。由于缺乏專門定義 BASCs 的單一最佳標(biāo)記基因，無(wú)法使用傳統(tǒng)的 Cre-loxP 介導(dǎo)的譜系追蹤方法追逐 BASCs 的分化命運(yùn)，而通過(guò)雙標(biāo)志物就可以特異性地追蹤Scgb1a1⁺Sftpc⁺ BASC。

圖. 單色交叉報(bào)告基因系統(tǒng)^[1]

1 A^-B^- 細(xì)胞：
該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，遇到 stop 序列被終止表達(dá)，細(xì)胞未被染色。

2 A⁺B^- 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照第一個(gè)啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato。

3 A^-B⁺ 細(xì)胞：
makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（第二個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照第二個(gè)啟動(dòng)子的方向，表達(dá)綠色熒光 zsGreen。

4 A⁺B⁺ 細(xì)胞：
makerA 介導(dǎo) Cre 酶表達(dá)，Cre 酶會(huì)切除兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的序列（第一個(gè) stop 序列被切除），makerB 介導(dǎo) Dre 酶表達(dá)，Dre 酶會(huì)切除兩個(gè) Rox 位點(diǎn)之間的序列（第二個(gè) stop 序列被切除），之后，該系統(tǒng)按照啟動(dòng)子的方向，表達(dá)紅色熒光 tdTomato 與綠色熒光 zsGreen，兩個(gè)蛋白的顏色重疊后，呈現(xiàn)出黃色熒光。

因此，A⁺B^- 細(xì)胞被標(biāo)記為紅色；A^-B⁺ 細(xì)胞被標(biāo)記為綠色；A⁺B⁺ 細(xì)胞可被標(biāo)記為黃色。

案例2
如下圖中，細(xì)支氣管細(xì)胞標(biāo)志物 Scgb1a1 陽(yáng)性的細(xì)胞會(huì)被標(biāo)記為紅色，肺泡2型細(xì)胞標(biāo)志物 Sftpc 的細(xì)胞會(huì)被標(biāo)記成綠色，而雙陽(yáng)性的細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞 （BASC）由于同時(shí)表達(dá)紅色與綠色熒光而被標(biāo)記為黃色。這樣可以通過(guò)不同的顏色準(zhǔn)確區(qū)分不同來(lái)源的細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞群命運(yùn)可塑性的理解。

圖. 多色交叉報(bào)告基因系統(tǒng)^[1]