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Bone Research文獻解讀:內源性PDGFR-β調節血管形成與骨形成機制

瀏覽次數:904 發布日期:2024-4-25  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

長久以來,骨關節炎都是廣泛存在的關節退行性變,目前以軟骨為中心的OA發病機制觀點正轉向全關節模型。部分前沿研究顯示軟骨下骨退化是導致關節面覆蓋軟骨退化的重要觸發點,進而導致關節軟骨負荷改變,隨后發展成骨關節炎。隨著研究不斷深入,不少結果提示毛細血管,尤其是H型血管與骨組織之間復雜的動態交流是骨建模和骨重塑過程中必不可少的。同時有研究指出敲除PDGFR-β基因可以影響腫瘤細胞中的病理性血管生成。然而,在骨關節炎進程中內皮源PDGFR-β調節軟骨下H型血管的機制尚不清楚。

南方醫科大學南方醫院創傷骨科余斌團隊Bone Research發表了題為“Endothelial PDGF-BB/PDGFR-β signaling promotes osteoarthritis by enhancing angiogenesis-dependent abnormal subchondral bone formation”的文章。南方醫科大學南方醫院創傷骨科余斌教授為通訊作者。南方醫科大學南方醫院創傷骨科崔壯教授為該論文的第一作者。南方醫科大學南方醫院創傷骨科為該研究提供了技術和平臺支持。該研究以前交叉韌帶切除手術(ACLT)誘導創傷后骨關節炎小鼠這一模型為基礎,探索了PDGFR-β在骨關節炎中對H型血管的調節機制。

 

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圖片來源:Bone Research
(https://www.nature.com/articles/s41413-022-00229-6)


研究材料
該實驗使用了LoxP-flanked PDGFR-β(PDGFR-βlox/lox)和Cdh5-Cre小鼠(均由賽業生物提供)

研究方法
該實驗首先使用了組織化學、免疫熒光和組織形態學,用蘇木精和伊紅(H&E)染色計算鈣化軟骨(CC)與透明組織厚度之比、采用Safranin O/Fast Green (SOFG)染色檢測軟骨中的蛋白聚糖、采用免疫染色對軟骨下骨的PDGFR-β, endomucin, CD31, nestin, lepR, MMP13, ATAMDTS, SOX9, Aggrecan, 和COL II抗體進行了染色,并使用DAPI對細胞核進行標記。實驗使用了步態分析,馮·弗雷測試,流式細胞技術,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。

技術路線
01 骨關節炎中軟骨下骨與CD31 hiEmcnhi ECs的PDGFR-β表達分析
02 構建PDGFR-β基因敲除小鼠和細胞模型
03 PDGFR-β影響關節炎發病功能分析
04 PDGFR-β影響關節炎發病機制分析
05 PDGFR-β/talin1/FAK復合物的模型建立
06 PDGFR-β/talin1/FAK復合物影響H型血管功能分析

研究結果

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圖1 骨關節炎發病過程中,軟骨下骨的PDGFR-β表達升高[1]
 

該研究首先采用了前交叉韌帶切除手術(ACLT)誘導創傷后骨關節炎小鼠與假手術小鼠對比,使用Westren Blot技術顯示出在OA患者的骨關節軟骨下骨PDGFR-β的表達量會顯著增加。其次使用了番紅染色、細胞免疫染色技術發現,ACLT術后小鼠軟骨下骨的軟骨細胞量會減少且PDGFR-β表達顯著增加。
 

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圖2 PDGFR-β在CD31 hiEmcnhi ECs中高表達[1]


首先qRT-PCR技術對從骨髓中取出的CD31 hiEmcnhi ECs和CD31 loEmcnlo ECs中PDGFR-β進行了檢測,結果顯示PDGFR-β在CD31 hiEmcnhi ECs中表達較高。隨后通過FACS技術從OA術后4周、OA術后8周和空白組小鼠中分選軟骨下CD31 hiEmcnhi ECs。再使用qRT-PCR、細胞免疫熒光染色技術,結果顯示骨關節炎小鼠的CD31 hiEmcnhi ECs與PDGFR-β都會顯著升高。
 

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圖3 PDGFR-β基因敲除小鼠關節炎進程減緩[1]


為了探究骨關節炎進程是不是與PDGFR-β有關,研究采用了LoxP-flanked PDGFR-β和Cdh5-Cre小鼠(由賽業生物提供)構建PDGFR-β基因敲除小鼠進一步驗證,使用SOFG染色、HE染色、免疫熒光染色技術,分別對OA術后4周和8周的PDGFR-β-/-與PDGFR-βlox/lox小鼠進行染色,對比軟骨下骨化程度、軟骨退化程度和MMP13、Sox9、ADAMTS5、ColII、Aggrecan的顯影,結果表明PDGFR-β基因敲除小鼠的骨關節炎發展進程明顯減緩。
 

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圖4 PDGFR-β-/-小鼠軟骨下CD31 hiEmcnhi ECs減少[1]
 

研究為了驗證CD31 hiEmcnhi ECs表達是否受到PDGFR-β影響,研究繼續在PDGFR-β基因敲除的小鼠中驗證,首先通過FACS從不對條件處理的PDGFR-βlox/lox和PDGFR-β−/−小鼠中分離CD31 hiEmcnhi ECs。再通過qRT-PCR和細胞免疫熒光染色技術,驗證出敲除PDGFR-β后CD31 hiEmcnhi ECs表達將減少。
 

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圖5 PDGFR-β通過形成PDGFR-β/talin1/FAK復合物在體內發揮作用[1]


為了探究現象背后的潛在機制,該研究使用了LC-MS/MS在BMEC中分析鑒定出了PDGFR-β結合蛋白FAK和TLN1。再通過免疫共沉淀技術確定了PDGFR-β與FAK、TLN1相結合。最后通過蛋白印跡技術,檢測PDGFR-BB或FAK抑制劑或TLN1 siRNA處理的BMEC中FAK、TLN1和VEGF表達情況。結果顯示PDGFR-BB可以激活PDGFR-β復合物并具有時間和劑量依賴性,而FAK抑制劑和TLN1都會抑制VEGFR表達。
 

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圖6 PDGFR-β/talin1/FAK復合物促進血管生成[1]


為了進一步確認PDGFR-β/talin1/FAK復合物在血管生成中起到的作用。通過攜帶PDGFR-β基因病毒轉染的方式,超表達和抑制PDGFR-β。使用ELISA技術確認VEGF在不同病毒轉染的BMECs的表達情況,在試管形成實驗中設置PDGFR-β過表達組、PDGFR-β抑制組、talin1抑制組和FAK抑制組研究BMECs的總回路、總分支點和總長度。再通過CCK-8和劃痕實驗檢測以上條件下BMECs的增殖和運動量化分析。結果表明PDGFR-β通過與talin1、FAK形成復合物的形式來促進血管的生成。
 

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圖7 內源性PDGFR-β可以抑制骨關節炎進程[1]


為了探索內源性PDGFR-β對于OA的影響,通過注射AAV9抑制內源性PDGFR-β在ACLT處理后小鼠的表達。使用免疫熒光技術對endomucin,CD31和LepR或Nestin染色,結果顯示抑制PDGFR-β可以緩解ACLT術后小鼠關節炎病程。同時可以使OA小鼠骨小梁模式因子、軟骨下骨骨板厚度、骨量/總組織體積和小梁骨數情況逆轉趨向正常。并且研究通過SOFG染色技術顯示出抑制PDGFR-β可以減緩軟骨的降解。

研究結論
綜上,目前的研究顯示,研究者發現PDGFR-β在OA患者、老年小鼠和創傷性OA小鼠的軟骨下骨中顯著升高,并且PDGFR-β主要在軟骨下骨中的CD31 hiEmcnhi ECs表達。值得關注的是,在軟骨下骨局部注射AAV9抑制內源性特異性PDGFR-β后,異常的基于H型血管的骨形成和骨關節炎進程都緩解了。除此之外,該研究還發現了在PDGFR-β基因敲除小鼠的PDGFR-β會在ACLT術后4周后開始升高,這表明ACLT后升高的PDGFR-β可能有其他來源如周皮細胞。作者認為在OA的刺激下,軟骨下單核破骨細胞前體釋放出大量的PDGFR-BB,與CD31 hiEmcnhi ECs與周皮細胞上的PDGFR-β相結合,促進了周皮細胞向CD31 hiEmcnhi ECs募集,共同促進了在骨關節炎中基于異常H型血管的軟骨下骨形成。

總而言之,PDGFR-β通過PDGFR-β/talin1/FAK通路促進H型血管的形成并導致異常的骨形成,并且抑制PDGFR-β或使其失去功能可以緩解骨關節炎的病程,此外,研究提供了在骨關節炎發展過程中內源性PDGFR-β調節血管形成與骨形成的機制。因此,PDGFR-β被確定成為了骨關節炎潛在有效的新靶點。

原文檢索:

[1]Cui Z, Wu H, Xiao Y, Xu T, Jia J, Lin H, Lin R, Chen K, Lin Y, Li K, Wu X, Li C, Yu B. Endothelial PDGF-BB/PDGFR-β signaling promotes osteoarthritis by enhancing angiogenesis-dependent abnormal subchondral bone formation. Bone Res. 2022 Aug 29;10(1):58. doi: 10.1038/s41413-022-00229-6. PMID: 36031625; PMCID: PMC9420732.

發布者:賽業(蘇州)生物科技有限公司
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