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點突變細胞模型的構建的方法與注意事項

瀏覽次數:1025 發(fā)布日期:2023-3-23  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

全球有超過50,000種人類相關的遺傳疾病,其中大部分是由基因組的點突變(point mutation, PM)引起的。而對于罕見病而言,80%是由基因缺陷引起的,同時這些基因缺陷中點突變又占了60%。研究表明,點突變能使人類對癌癥、聽力疾病、精神病等多種疾病的易感性增加。

研究點突變相關遺傳疾病,免不了要構建細胞模型。點突變細胞模型可以直接研究細胞信號傳導、代謝和分化等機制,是研究基因功能和調控、癌癥、遺傳疾病等生物學和醫(yī)學問題的重要工具,具有精確模擬基因變異、可控性高、安全省時等優(yōu)點。
 

點突變細胞模型的構建

構建細胞點突變細胞模型時的理論基礎是基因的同源重組修復。當細胞基因組DNA雙鏈由于外部因素而斷裂時,細胞中存在著的DNA修復機制就會被激發(fā),對斷裂位點的DNA雙鏈進行修復,根據修復方式的不同可分為同源重組修復和非同源重組修復。顧名思義,同源重組是指DNA在修復的過程中以同源的DNA序列作為模板完美修復,而非同源重組修復是指細胞內的相關蛋白直接將斷裂的DNA兩端重新連起來,同時可能會隨機引入新的堿基。
 

罕見病基因治療峰會
DNA雙鏈斷裂修復途徑。(A. 同源重組修復,B. 非同源重組修復)


根據這個理論基礎,點突變細胞模型的構建分為三個部分:

1.定點切割DNA
由于在自然界中DNA的斷裂是隨機的、不確定的,因此我們需要人為定點對DNA產生切割。在這個過程中,CRISPR-Cas9技術給我們提供了極大的便利。我們可以通過人為設計sgRNA,并將Cas9蛋白與sgRNA一起轉染到目的細胞中。在sgRNA的引導下,Cas9蛋白對靶位點處的DNA進行切割,產生DNA雙鏈斷裂。

2.同源重組修復DNA
我們通過CRISPR-Cas9技術使細胞內的基因組DNA產生了雙鏈斷裂后,同時引發(fā)了細胞內的DNA修復機制。因此,為了使DNA在修復過程中能通過同源重組的方式修復DNA并引入突變位點,我們需要為細胞提供額外的同源修復模板。這個模板的本質是人為合成的DNA序列,由5’端同源臂、突變位點和3’端同源臂組成。值得注意的是,這種同源模板序列是隨sgRNA和Cas9蛋白一起轉染進細胞的。

3.陽性細胞篩選
這部分是細胞模型構建的關鍵部分。試想下,我們通過細胞轉染技術將CRISPR-Cas9系統(tǒng)和模板DNA序列轉入細胞中后,由于細胞內部機制的作用,我們得到的細胞池中既包含純合子陽性細胞和雜合子細胞,又包含沒有發(fā)生堿基突變的野生型細胞。那么,我們該如何挑選出目的細胞呢?對于點突變模型來說,由于沒有引入抗性基因,常用的方法便是通過稀釋法將細胞池的細胞稀釋轉移到96孔板中,形成單克隆細胞,然后收集單克隆細胞進行大量測序,以得到預期的純合子細胞。
 

點突變細胞模型推薦

由于人類疾病中基因產物并非總是如轉基因一樣的高表達,也不是像基因敲除一樣完全不表達,很多情況下只是因單個或者少數幾個堿基的改變而造成的蛋白結構改變,表現為非正常激活或抑制。因此,構建精細的、與疾病對應的點突變細胞模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案,而CRISPR-Cas9技術則使得我們能夠以更低的成本和更高的效率實現這一目標。

經大量測試和實驗工藝優(yōu)化,賽業(yè)生物開發(fā)了Smart-CRISPR™細胞基因編輯系統(tǒng),實現更深度的基因信息分析和更合理的gRNA設計。基于該系統(tǒng),我們能提供準確快速的點突變細胞模型構建服務,通過優(yōu)化的α-donor體系將人源化的Cas9蛋白、gRNA和donor三組分轉染至目的細胞,產生高效同源重組,實現純合子交付,快至八周。現在下單,HEK293T、A549、HCT 116、HEK293等多種細胞的點突變項目均可享受3.98萬的優(yōu)惠價格。

 

基因編輯細胞系實用指南

基因敲除的sgRNA要如何設計?又要如何檢測脫靶?為什么篩選出了很多單克隆雜合子,但無法篩選出純合子?對于這些問題,做基因編輯細胞系的小伙伴們應該不會感到陌生。這本基因編輯細胞系常見問題解答將為你答疑解惑,掃碼免費下載領取電子版,距你理想的研究目標又近了億點點!

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