激素性股骨頭壞死（SONFH）是一種臨床上常見的進行性骨病，近年來發病率不斷上升，占股骨頭壞死總病例的25-51%。若不及時治療，會導致股骨頭結構改變及塌陷，引起髖關節疼痛及功能障礙。

 

研究表明，骨髓間充質干細胞（BMSC）可以促進骨修復，有望治療早期激素性股骨頭壞死。然而，SONFH有一個獨特的病理因素，即患者股骨頭壞死區的氧濃度通常低于1%，形成了局部缺氧微環境，可導致BMSC發生缺氧性凋亡，并限制了其成骨修復能力。因此，目前急需開發新方法來抑制缺氧引起的BMSC凋亡和提高BMSC移植的療效。

 

貴州醫科大學附屬醫院研究團隊發現，長鏈非編碼RNA Tmem235在這種缺氧環境中下調。他們通過一系列實驗表明，Lnc Tmem235可抑制BMSC的缺氧性凋亡，從而改善BMSC治療早期激素性股骨頭壞死的效果。這項研究成果已發表在《Experimental & Molecular Medicine》雜志上。

 

文獻封面截圖^[1]

 

研究材料與方法

在這項研究中，研究人員從雄性SD大鼠中提取出BMSC，并利用賽業OriCell^®提供的大鼠BMSC成骨、成脂、成軟骨誘導分化試劑盒驗證了BMSC的誘導分化性能。然后，通過lncRNA芯片分析篩選出與BMSC缺氧性凋亡相關的lncRNA，并通過基因過表達和沉默分析來探究Lnc Tmem235抑制BMSC凋亡的具體機制。最后，利用雄性SD大鼠構建了早期激素性股骨頭壞死模型，并在移植BMSC后利用micro-CT系統監測了骨結構和骨密度。

 

技術路線

探討缺氧環境對BMSC的影響，通過lncRNA芯片和過表達等分析確定，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡
 

通過過表達和干擾分析確定Lnc Tmem235通過調節BIRC5的表達，來抑制BMSC的缺氧性凋亡
 

深入分析機制后發現Lnc Tmem235與BIRC5 mRNA競爭性結合miR-34a-3p，從而促進BIRC5的表達
 

在早期激素性股骨頭壞死模型中，Lnc Tmem235通過抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC移植的治療效果
 

研究結果

01 Lnc Tmem235抑制BMSC的缺氧性凋亡

研究人員從骨髓中成功分離出BMSC，并探討了不同缺氧環境對BMSC的影響。由于股骨頭壞死區的氧氣濃度低于1%，故他們用0%的氧氣濃度來建立BMSC的體外缺氧模型。結果顯示，BMSC暴露于缺氧環境后，線粒體膜電位和ATP水平下降，而ROS水平上升。同時，大量的BMSC發生凋亡。

 

考慮到lncRNA在細胞凋亡的調控中發揮重要作用，接下來有哪些lncRNA與缺氧誘導的BMSC凋亡有關呢？lncRNA芯片分析顯示，在缺氧條件下有99個lncRNA上調，183個lncRNA下調。進一步分析表明，Lnc Tmem235在BMSC缺氧模型中的表達明顯下調，且其表達隨缺氧程度的加重和凋亡比例的增加而持續下調。這些結果表明，Lnc Tmem235可能與BMSC的缺氧性凋亡有關。

 

Lnc Tmem235基因座位于10號染色體上，處于BIRC5基因的下游。研究人員發現，Lnc Tmem235不具備編碼蛋白質的能力，主要分布在BMSC的細胞質內。在缺氧條件下，Lnc Tmem235和Bcl-2的表達水平下調，Bax和CASP-3的表達水平上調，BMSC凋亡比例超過70%。然而，Lnc Tmem235的過表達逆轉了這些結果，促進了BMSC在缺氧條件下的存活（圖1）。這表明，Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡。
 

Lnc Tmem235抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]

 

02 Lnc Tmem235通過調節miR-34a-3p/BIRC5軸抑制BMSC的凋亡

那么，Lnc Tmem235是通過何種機制抑制BMSC的缺氧性凋亡呢？研究人員在BMSC中過表達Lnc Tmem235后，通過芯片分析來檢測細胞的基因表達譜，發現BIRC5的表達明顯上調。之后的qPCR分析證實了芯片分析的結果。作為凋亡抑制劑，BIRC5可直接抑制CASP-3和CASP-9的活性，阻斷細胞凋亡。因此，他們推測Lnc Tmem235通過調節BIRC5的表達來抑制BMSC凋亡。

 

在上調Lnc Tmem235的表達后，他們用慢病毒干擾載體下調了BIRC5的表達，發現BIRC5的下調明顯削弱了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。相反，在Lnc Tmem235表達被下調后，BIRC5的過表達有效減輕了缺氧誘導的BMSC凋亡。這些結果證實，Lnc Tmem235通過調節BIRC5的表達來抑制BMSC的缺氧性凋亡。

 

研究人員推測，也許有某個miRNA與BIRC5 mRNA結合，而Lnc Tmem235通過競爭性結合miRNA來釋放miRNA對目標基因的沉默，最終促進BIRC5的表達。他們通過生物信息學工具將目標鎖定為miR-34a-3p。

 

通過RIP分析，他們發現miR-34a-3p的過表達明顯增加了Lnc Tmem235和BIRC5 mRNA在miRNA核糖核蛋白復合物（miRNP）中的富集。熒光素酶活性分析也顯示，miR-34a-3p可以與Lnc Tmem235或BIRC5 mRNA上的預測位點結合。后續分析表明，Lnc Tmem235可作為ceRNA，與BIRC5 mRNA競爭性結合miR-34a-3p，從而解除miR-34a-3p對BIRC5 mRNA的沉默，最終促進BIRC5的表達。

 

當BMSC處于缺氧狀態時，Lnc Tmem235的過表達導致BIRC5表達被上調，細胞凋亡明顯減少。在此基礎上上調miR-34a-3p的表達，則BIRC5表達下降，細胞凋亡增加。這表明miR-34a-3p阻斷了Lnc Tmem235的抗凋亡作用。之后，研究人員又上調了BIRC5的表達，發現細胞凋亡減少（圖2）。這些結果表明，Lnc Tmem235通過調節miR-34a-3p/BIRC5軸抑制了BMSC的缺氧性凋亡。

 

Lnc Tmem235通過調節miR-34a-3p/BIRC5抑制了BMSC的缺氧性凋亡^[1]
 

03 Lnc Tmem235促進早期激素性股骨頭壞死的修復

此外，研究人員利用脂多糖和甲潑尼龍建立了早期激素性股骨頭壞死模型。他們發現，在骨壞死區的缺氧微環境中，大量的移植BMSC出現缺氧誘導的凋亡，嚴重限制了BMSC移植的效果。既然Lnc Tmem235能夠抑制BMSC的缺氧性凋亡，那么它是否能改善BMSC對早期SONFH的治療效果？

 

他們在過表達或沉默Lnc Tmem235后，用DiR標記BMSC，并與異種脫抗原松質骨（XACB）共同培養來構建組織工程骨，以修復早期SONFH模型。與對照組相比，Lnc Tmem235過表達組的DiR熒光強度和BIRC5表達水平更高，TUNEL陽性細胞的比例明顯下降，而在Lnc Tmem235低表達組中，TUNEL陽性細胞比例增加。這表明Lnc Tmem235抑制了缺氧微環境中BMSC的凋亡，促進了BMSC的存活。

 

在手術后12周，他們通過多個指標評估了BMSC的修復效果。與對照組相比，Lnc Tmem235過表達組的缺損區完全修復，且骨組織趨于成熟。骨小梁數目、骨小梁厚度、骨體積、骨體積分數以及多個成骨標志物的水平都明顯增加。相反，Lnc Tmem235低表達組的各項指標都明顯低于對照組。這些結果表明，Lnc Tmem235通過抑制BMSC的缺氧性凋亡，改善了BMSC對早期SONFH的治療效果。

 

結論

Lnc Tmem235在通過移植BMSC修復早期SONFH中的作用和機制^[1]

 

總的來說，這項研究表明Lnc Tmem235通過調節miR-34a-3p/BIRC5來抑制BMSC的缺氧性凋亡，而這種抑制改善了BMSC對早期激素性股骨頭壞死的治療效果（圖3）。這項研究為減少BMSC的缺氧性凋亡和改善BMSC移植的療效提供了一個新的靶點和方法。

 

原文檢索

[1] Zhang, F., Peng, W., Wang, T. et al. Lnc Tmem235 promotes repair of early steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by inhibiting hypoxia-induced apoptosis of BMSCs. Exp Mol Med 54, 1991–2006 (2022). https://doi.org/10.1038/s12276-022-00875-0