慢性淋巴細胞白血病（CLL）是一種惰性的血液系統癌癥，通常進展緩慢。大多數患者在早期并沒有癥狀，僅僅是因為白細胞計數增加才被診斷出。CLL的特點是成熟的CD5⁺B細胞在血液和淋巴器官中積累。盡管多種藥物的治療效果良好，但侵襲性病例會產生耐藥性。

CLL細胞高度依賴于腫瘤微環境。歸巢到外周淋巴器官和骨髓對于CLL細胞至關重要，可使其進入腫瘤保護小生境，并接收促生存信號。NEDD9是淋巴細胞遷移的關鍵調控因子，大量研究表明，它能夠促進腫瘤生長和擴散。不過，NEDD9在淋巴細胞白血病中的作用還不大清楚。

近日，德國科隆大學領導的研究團隊利用小鼠模型來破譯NEDD9在CLL發病機制中的功能相關性。他們發現NEDD9是白血病細胞遷移和疾病進展所必需的。這項研究成果于2022年5月發表在《Leukemia》雜志上。
 

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了慢性淋巴細胞白血病經典的Eµ-TCL1小鼠模型，并委托賽業生物構建了Nedd9條件性敲除小鼠模型。研究者還采集了CLL患者和健康對照的原代CLL細胞及淋巴結活檢樣本，主要開展了細胞歸巢和遷移分析，以及細胞粘附分析。

技術路線
01研究Nedd9敲除對CLL疾病進展的影響

02確定Nedd9缺失對CLL細胞歸巢的影響

03分析CLL患者的NEDD9表達水平，確定其臨床意義

04研究NEDD9相關通路的阻斷是否可減少CLL細胞遷移

研究結果
1.Nedd9的缺失延遲了CLL的進展
Eµ-TCL1小鼠模型被廣泛用于慢性淋巴細胞白血病的研究。基于Eµ-TCL1模型，研究人員構建了TCL1（TCL1^tg/wtNedd9^wt/wt）和TCL1-N（TCL1^tg/wtNedd9^−/−）小鼠，以分析組成型的Nedd9敲除對CLL發病機制的影響。有趣的是，與TCL1組相比，TCL1-N組的總生存期大大延長。這種生存差異反映了Nedd9的缺失顯著延遲了CLL發作。

同時，免疫組化染色結果顯示，CD45R⁺B細胞嚴重浸潤TCL1小鼠的脾臟和骨髓，但TCL1-N小鼠中的浸潤卻很有限。由此可見，TCL1-N小鼠骨髓和脾臟中的CLL浸潤與TCL1小鼠相比明顯減少。這些結果表明，Nedd9的缺失顯著延遲了CLL的發作和進展，特別是破壞了CLL細胞在淋巴器官中的浸潤，使小鼠獲得了明顯的生存優勢。

為了研究B細胞特異性的Nedd9缺失是否影響CLL發病機制，研究人員委托賽業生物構建了一個Nedd9條件性敲除小鼠模型，其中Nedd9僅在B細胞譜系中缺失（圖1）。他們將該基因型小鼠與TCL1小鼠雜交，生成了B細胞缺失Nedd9的TC-N（TCL1^tg/wtCD19Cre^tg/wtNedd9^flfl）小鼠和作為對照的TC（TCL1^tg/wtCD19Cre^wt/wtNedd9^flfl）小鼠。與TC小鼠相比，TC-N小鼠的CLL發病顯著延遲，CLL細胞向骨髓和脾臟的浸潤也減少。第二個獨立的小鼠模型再次證實了Nedd9在CLL發病機制中的作用，并強調了B細胞內在的Nedd9活性是這種影響的主要貢獻者。
 

圖1 B細胞特異性的Nedd9缺失可降低小鼠的CLL疾病負荷

2.Nedd9缺失破壞CLL細胞歸巢至淋巴器官
接下來，研究人員深入探索了其中的機制。多個實驗的結果并未顯示NEDD9對B細胞增殖、凋亡或BCR信號通路有重大影響。那么，Nedd9缺失是否會改變CLL細胞歸巢？他們對TCL1和TCL1-N CLL細胞開展了短期歸巢分析。

他們將CFSE標記的CLL細胞注射到受體小鼠內，3小時后收集器官進行浸潤分析。與TCL1細胞相比，TCL1-N CLL細胞較少浸潤到受體的脾臟中，不過骨髓浸潤沒有差異。免疫缺陷型NSG小鼠的結果也類似。這些數據表明，Nedd9促使CLL細胞有效歸巢至淋巴組織，這是導致CLL進展的重要機制。

細胞粘附和遷移是淋巴細胞歸巢中的基本過程，于是他們開展了細胞粘附分析。TCL1-N CLL細胞完全無法粘附到纖連蛋白（CLL歸巢中的主要粘附分子），對BMSC的粘附也顯著受損。此外，Nedd9的缺失導致CLL細胞遷移明顯減少。因此，研究人員認為，NEDD9的缺失主要是通過破壞CLL細胞粘附和遷移而影響其歸巢。

3.NEDD9的臨床意義
研究人員從CLL患者和健康對照的外周血中分離出B細胞，并檢測了磷酸化NEDD9和總NEDD9的表達水平。分析結果表明，NEDD9在CLL細胞中持續激活，對細胞刺激（如BCR激活）的反應喪失（圖2）。基因關聯分析表明，NEDD9 mRNA在外周血CLL細胞中的表達與粘附和遷移信號通路高度相關，而且人類CLL淋巴結經常高水平表達NEDD9，部分患者的NEDD9表達在CLL增殖中心富集。同時，NEDD9水平還與白細胞計數之間存在強的正相關，而白細胞計數正是CLL侵襲性的標志。這些結果都提示了NEDD9在CLL發病機制中的功能性作用。
 

圖2 NEDD9表達與CLL細胞的粘附和遷移特征相關

他們進一步推測，在Nedd9敲除細胞中，CXCL12的趨化性受損是細胞內的信號轉導網絡出現缺陷的結果。目前已知NEDD9能夠共激活AURKA/HDAC6信號軸，誘導細胞骨架變化。于是他們分析了AURKA抑制劑和HDAC抑制劑是否能夠阻斷CLL細胞遷移。他們發現，兩種抑制劑都能顯著降低CLL細胞的遷移和趨化性。這些數據表明，靶向NEDD9相關通路（如AURKA-HDAC6-CTTN信號通路）是一種有潛力的策略，可預防CLL歸巢，從而限制疾病進展。

研究結論

總的來說，這項研究提供了強有力的證據，說明NEDD9在CLL發病機制中發揮功能性作用。這些結果可以加深人們對CLL歸巢機制的了解，也有望為CLL患者設計其他的治療方法，以阻止CLL細胞遷移和疾病進展。

賽業小鼠模型構建
賽業生物『紅鼠資源庫』可提供同類型C57BL/6J-Nedd9^em1(flox)Cya條件性基因敲除小鼠，有助于科學研究。
 

Nedd9條件性基因敲除小鼠

品系名稱：C57BL/6J-Acaca^em1Cya
品系編號：C57BL/6J-Nedd9^em1(flox)Cya
產品編號：S-CKO-03919

應用方向：
❖ 免疫系統、神經系統
❖ 細胞分化、信號傳導
❖ 行為/神經

打靶方案：

原文檢索：
Rusyn, L., Reinartz, S., Nikiforov, A. et al. The scaffold protein NEDD9 is necessary for leukemia-cell migration and disease progression in a mouse model of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 36, 1794–1805 (2022). https://doi.org/10.1038/s41375-022-01586-1