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引物合成的步驟及方法介紹

瀏覽次數(shù):2299 發(fā)布日期:2017-6-3  來源:原創(chuàng)

   Oligo DNA的人工化學(xué)合成始于50年代初期,1980年,全自動的固相DNA合成儀面市后,使得快速、高效合成Oligo DNA成為可能,這大大地推動了生物工程技術(shù)的蓬勃發(fā)展。

   現(xiàn)在一般都采用β-乙腈亞磷酰胺化學(xué)合成Oligo DNA,將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的合成時從3' →5' 方向進(jìn)行,通常3' 端的第一個堿基結(jié)合在Glass擔(dān)體 (Controlled Pore Glass,CPG)上。其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。

合成步驟
  Step1:脫掉附加在CPG擔(dān)體上的第一個堿基5' -OH基團上的保護(hù)基 (DMTr),準(zhǔn)備附加下一個新的堿基;
  Step2:活化新的堿基單體 (Phosphoramidite),準(zhǔn)備與第一個堿基進(jìn)行反應(yīng);
  Step3:第二個堿基與第一個堿基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng);
  Step4:將沒有反應(yīng)的第一個堿基的5' -OH加帽封死 (Capping),使其不再進(jìn)一步參與反應(yīng);
  Step5:將核苷亞磷酸酯氧化成更穩(wěn)定的核苷磷酸酯 (即將三價磷氧化成五價磷)。
  Step6:重復(fù)進(jìn)行Step1~Step5的循環(huán),直至合成完所需的Oligo DNA序列。
  Step7:合成結(jié)束后,將Oligo DNA分子從CPG上切下,再進(jìn)行進(jìn)一步的純化。


圖1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一個堿基,N2代表第二個堿基,依此類推。

OD數(shù)的確定

   一般PCR擴增,2 OD引物,可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接,1 OD就足夠了。但是有些研究人員,就做幾次PCR,但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長,但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。片段越長, 最后全長得率就越低,出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求,也是一種浪費。

引物純度檢測

   實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和,上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性,二是增加樣品比重,容易加樣。600V電壓進(jìn)行電泳,一定時間后(約2-3小時),剝膠,用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型,在主帶之下沒有雜帶,說明純度是好的。如果條件許可,也可以用EB 染色或銀染方式染色。

引物級別選擇

發(fā)布者:武漢金開瑞生物工程有限公司
聯(lián)系電話:027-62431110
E-mail:3013422302@qq.com

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