層浪流式筆記——單平臺法絕對計數
絕對計數在流式檢測中是我們檢測的重要指標之一，定義是單位體積樣本（如血液樣本）中，含有某種類別細胞的數目。常用的絕對計數的方法有：雙平臺法和單平臺法，單平臺法絕對計數主要分為微球法和直接體積法。雙平臺法操作繁瑣和誤差大等原因，應用較少，目前市場上絕對計數以單平臺法為主。應用領域：淋巴亞群、HIV免疫檢測、菌群、藻類等項目的絕對計數。
微球法絕對計數：
微球法是流式細胞術中最早用來開展單平臺絕對計數的方法，目前被廣泛使用和認可。用絕對計數微球來計算混合復雜的細胞群體中（如血樣）目的細胞群的絕對細胞數量的。絕對計數微球是4 - 10 μm的熒光微球，可以被市面上幾乎所有的流式常用的激發光激發（具體根據廠家說明書）。層浪開發的ModelFlower流式軟件，內置微球法絕對計數算法，無需人工計算可直接得出圈內目的細胞群的絕對計數值。計算公式為：
樣本準備流程：
1. 反吸法取50 μl抗凝全血加入TruCount Tubes內;
2. 加入抗體染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根據說明書每個抗體加入5 μl，室溫避光孵育20 min（抗體用量和孵育時間根據說明書建議）;
3. 直接入加入435 μl紅細胞裂紅液（總體系500 μl），因抗體量不同有所差異），室溫避光孵育15 min（不同廠家可調整孵育時間）；
4. 直接上機檢測；
5. 設置條件，圈Beads門，微球總數，以及樣本體積，軟件可以自動計算圈出的淋巴亞群的絕對計數值，無需人工計算（單位：個 / μl）。
圖1. 微球法絕對計數條件設置
檢測和數據分析結果：
圖2. 微球法絕對計數結果
圖示：圖A為CD45和SSC圈出淋巴細胞群，右上角為絕對計數微球的信號；絕對計數微球的圈門通常用FITC和PE雙參數，如圖B所示；從圖A中的Lym群，圈CD3的信號，如圖C所示；然后再從CD3門中圈出CD3+CD4+的信號，如圖D所示；圖E展示各個細胞群的顆粒數、百分比（%Parent）和微球法絕對計數（絕對計數-B）的結果。
體積法絕對計數：
體積法絕對計數計算公式為：細胞絕對數量（個/μl）=N（圈內總的細胞數）/V(上樣體積）。市面上體積法絕對計數的流式細胞儀有蠕動泵和注射泵兩種，其中蠕動泵容易發生形變，可能影響計數的結果，要求時常更換蠕動泵；而注射泵相比蠕動泵，不用考慮形變問題，而且注射泵勻速推動樣本上樣，上樣更穩定，以及對體積的計算更加準確。
樣本準備流程：
1. 反向吸樣取50 μl抗凝全血加入流式管內;
2. 加入抗體染色，CD45 - PerCp，CD3 - Violet610，CD4 - FITC，根據說明書每個抗體加入5 μl，室溫避光孵育20 min（抗體用量和孵育時間根據說明書建議）;
3. 直接加入435 μl紅細胞裂紅液（總體系500 μl），因抗體量不同有所差異），室溫避光孵育15 min（不同廠家可調整孵育時間）；
4. 直接上機檢測；
5. 設置絕對計數條件，設置檢測樣本稀釋倍數（10倍），統計區可直接獲得體積法絕對計數的結果。
圖3. 體積法絕對計數條件設置
檢測和數據分析結果：
圖4. 體積法絕對計數結果
圖示：圖A為CD45和SSC圈出淋巴細胞群；從圖A中的Lym群，圈CD3的信號，如圖B所示；然后再從CD3門中圈出CD3+CD4+的信號，如圖C所示；圖D展示各個細胞群的顆粒數、百分比（%Parent）和體積法絕對計數（絕對計數-V）的結果。
微球法和體積法一致性分析，同時使用體積法和微球法兩種方法對淋巴細胞絕對計數的一致性進行分析（n = 10），如圖5所示。兩種方法檢測的相關系數R2為0.9928，接近1，表明兩種絕對計數檢驗方法一致性較好。
圖5. 體積法和微球法一致性檢測
總結：
層浪流式細胞儀既可以微球法（免計算），又兼容體積法絕對計數。對比微球法和體積法絕對計數結果，Lym、CD3、CD3+CD4+的絕對計數結果基本一致，層浪流式細胞儀支持微球法和體積法對粒子進行絕對計數。層浪體積法絕對計數的優勢：結果精確，依賴于精準的柱塞泵吸樣模式；節約成本，無需額外購買絕對計數微球；耗材損耗小，無需頻繁更換蠕動泵管；針對小顆粒菌群、藻類的檢測，有更可靠的準確性。
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層浪聚焦流式細胞領域，致力于實現流式技術系統化、自動化、智能化，在臨床領域推動流式技術的常規化，在科研領域推進國產流式高端化。目前已推出多款流式產品：2激光8色流式細胞儀于2021年初成功獲得NMPA注冊證；高端產品科研型3激光14色流式細胞儀FongCyte™上市一年，儀器性能獲得客戶的高度認可；高端產品臨床型3激光14色流式細胞儀LongCyte™26種型號均獲CE認證。公司核心團隊均在流式技術領域有10余年經驗，十年如一日專注流式技術研究，致力于研發生產穩定、可靠、性能優異的產品。層浪未來將陸續推出更多高端流式產品，為中國的流式技術發展盡綿薄之力，做行業中流式技術普及者，做客戶信賴的流式伙伴，為中國的臨床和科研事業助飛。
