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一種細(xì)胞外囊泡通用標(biāo)記方法之聚糖錨定熒光標(biāo)記策略的研究與介紹

瀏覽次數(shù):28 發(fā)布日期:2025-7-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

在細(xì)胞外囊泡(EVs)的眾多來源中,牛奶來源的細(xì)胞外囊泡(milk-derived extracellular vesicles, mEVs)因其來源豐富、具有天然的生物活性和生物相容性等特性,被視為有潛力的下一代治療遞送平臺(tái)。mEVs 被開發(fā)用于口服藥物遞送的載體,保護(hù)治療藥物免受胃腸道降解,改善腫瘤的靶向治療。然而,要充分挖掘 mEVs 的治療潛力,需深入探究其細(xì)胞攝取行為及在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程,這需要依賴可靠的標(biāo)記技術(shù)。目前,常用的熒光標(biāo)記方法存在諸多問題:例如,親脂性染料標(biāo)記存在染料脫落、自聚集、轉(zhuǎn)移以及影響囊泡完整性等問題;常用的共價(jià)標(biāo)記技術(shù),如N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)酯染料標(biāo)記,需要借助蛋白表面的伯胺,可能會(huì)改變囊泡表面蛋白的功能;基因工程標(biāo)記則不適用于非培養(yǎng)來源的囊泡(如 mEVs),在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。因此,開發(fā)一種簡單、穩(wěn)定且對(duì)囊泡結(jié)構(gòu)和功能影響較小的標(biāo)記方法顯得尤為關(guān)鍵。

日前,集美大學(xué)陳超翔教授團(tuán)隊(duì)在 Small Methods 發(fā)表題為“Glycan-Anchored Fluorescence Labeling of Milk-Derived Extracellular Vesicles for Investigating Their Cellular Uptake and Intracellular Fate”的文章,報(bào)道了一種“聚糖錨定”熒光標(biāo)記策略。該策略通過氧化 mEVs 表面的唾液酸殘基,與熒光染料共價(jià)連接,從而實(shí)現(xiàn)對(duì) mEVs 的高效標(biāo)記。經(jīng)納米流式(NanoFCM)分析證實(shí)該方法的標(biāo)記效率近 100%,且 mEVs 的完整性和生物功能不受影響。這一創(chuàng)新的標(biāo)記技術(shù)為深入研究 mEVs 的細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及藥物遞送效率提供了有力的支持,有望推動(dòng)基于 mEVs 的新型藥物遞送系統(tǒng)的研發(fā)和臨床應(yīng)用。


01 聚糖錨定熒光標(biāo)記策略
研究者通過高碘酸鹽氧化 mEVs 表面的唾液酸產(chǎn)生醛基,再經(jīng)苯胺催化與含酰肼功能化的熒光團(tuán)(Cy5-酰肼)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記(圖1a)。然后,利用 NanoFCM 對(duì)標(biāo)記后的 mEVs 進(jìn)行分析,熒光檢測(cè)顯示約 100% 的 mEVs 成功標(biāo)記了 Cy5,證實(shí)該方法具有極高的標(biāo)記效率(圖1c, d)。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記不影響 mEVs 的物理性質(zhì)、蛋白標(biāo)志物和細(xì)胞攝取能力,且在不同溫度和 pH 條件下穩(wěn)定性良好,對(duì)多種來源的 EVs 均適用(圖2)。
 


圖1. NanoFCM 評(píng)估聚糖錨定熒光標(biāo)記 mEVs 的效率

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圖2. 聚糖錨定熒光標(biāo)記不同來源 EVs 的效率

02 與親脂性標(biāo)記方法的對(duì)比
研究者利用 NanoFCM 對(duì)聚糖錨熒光標(biāo)記方法與親脂染料標(biāo)記方法從標(biāo)記效率、穩(wěn)定性以及對(duì)囊泡特性的影響進(jìn)行系統(tǒng)比較。結(jié)果顯示,聚糖錨定標(biāo)記法在所有測(cè)試的 mEVs 濃度下,均展現(xiàn)出近乎 100% 的標(biāo)記效率,且不會(huì)引發(fā)囊泡的聚集或裂解(圖3a-d),充分顯示出該方法的高效性與穩(wěn)定性。而親脂性染料(如 DiD、PKH67、DiO)的標(biāo)記效果則因濃度依賴性導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定,低濃度時(shí)標(biāo)記效率不足,高濃度則導(dǎo)致 mEVs 聚集、裂解和染料自聚集(圖3)。
 
圖3. 通過 NanoFCM 比較聚糖錨定標(biāo)記與親脂性熒光標(biāo)記

03 mEVs 的細(xì)胞攝取和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)
研究者將 mEVs-Cy5 與 MCF-7 細(xì)胞共同孵育,通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),隨著孵育時(shí)間的延長,細(xì)胞的熒光強(qiáng)度在 8 小時(shí)達(dá)到峰值,隨后略有下降,表明 mEVs 攝取存在飽和狀態(tài)(圖4b, c)。此外,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與 Cy5 標(biāo)記密度呈嚴(yán)格的線性關(guān)系,這充分說明標(biāo)記過程并未影響 mEVs 的細(xì)胞攝取能力(圖4d)。進(jìn)一步,通過 NanoFCM 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基中 mEVs-Cy5 的濃度變化進(jìn)行準(zhǔn)確定量。結(jié)果顯示,與 MCF-7 細(xì)胞共孵育后,mEVs-Cy5 的濃度顯著降低,證實(shí)細(xì)胞成功攝取了 mEVs。經(jīng)基于濃度變化的計(jì)算,每個(gè) MCF-7 細(xì)胞平均攝取了約 2938 個(gè) mEVs(圖4h)。
 
圖4. mEVs 細(xì)胞攝取的定量分析

通過抑制劑實(shí)驗(yàn),研究者進(jìn)一步分析了 mEVs 在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)路徑,并確定其進(jìn)入細(xì)胞主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞和巨胞飲作用。此外,通過共聚焦激光熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn) mEVs 最初與溶酶體共定位,但 24 小時(shí)后部分 mEVs 成功從溶酶體中逃逸(圖5a-g)。上述發(fā)現(xiàn)揭示了 mEVs 在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)特征,為其在細(xì)胞質(zhì)中釋放藥物提供了潛在的作用機(jī)制和理論依據(jù)。
 
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圖5. mEVs 的細(xì)胞攝取途徑和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)难芯?/span>

04 藥物遞送和細(xì)胞毒性
為了評(píng)估 mEVs 作為藥物遞送載體的潛力,研究者將化療藥物紫杉醇(FITC標(biāo)記,PTX-FITC)裝載至 mEVs 中,并利用新方法實(shí)現(xiàn)雙重標(biāo)記(Cy5標(biāo)記mEVs,F(xiàn)ITC標(biāo)記藥物)。通過 NanoFCM 分析,發(fā)現(xiàn)約 90% 的 mEVs 成功裝載了 PTX-FITC,進(jìn)一步的共標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明,裝載了 PTX 藥物的 mEVs 均標(biāo)記上了 Cy5,雙陽性比例高達(dá) 86.6%。相比之下,傳統(tǒng)親脂性染料 DiD 標(biāo)記顯著減弱了 mEVs 載藥的能力(圖6b-d)。綜上結(jié)果表明,mEVs 具備高效裝載藥物的能力,且聚糖錨定標(biāo)記不影響 mEVs 的載藥能力。

進(jìn)一步通過 FCM 實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞攝取過程,結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi) Cy5 熒光強(qiáng)度在 8 小時(shí)達(dá)到峰值,而 FITC 熒光強(qiáng)度在 24 小時(shí)后顯著增加。此外,利用 FITC 的 pH 敏感熒光特性,研究者觀察到其熒光信號(hào)的變化,證實(shí)了 mEVs 能夠逃離溶酶體,并將攜帶的藥物以“爆發(fā)式”方式釋放至細(xì)胞質(zhì)中(圖6f-h)。癌細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)也顯示,mEVs-PTX-FITC 在作用 24 小時(shí)后顯示出顯著的細(xì)胞毒性(圖6i),這一結(jié)果證明,mEVs 能夠有效地將藥物遞送到細(xì)胞內(nèi),并發(fā)揮治療效果。
 
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圖6. mEVs 的載藥能力和細(xì)胞毒性分析

總 結(jié)
本研究通過開發(fā)基于聚糖錨定的熒光標(biāo)記技術(shù),克服傳統(tǒng)標(biāo)記方法的局限性,實(shí)現(xiàn)了對(duì) mEVs 的高效、穩(wěn)定標(biāo)記。此種標(biāo)記方法不會(huì)損害 mEVs 的完整性或攝取行為,也不會(huì)誘導(dǎo)囊泡聚集或染料泄漏,其綜合表現(xiàn)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的膜染料。已有數(shù)據(jù)表明,基于聚糖錨定的熒光標(biāo)記技術(shù)具有廣泛的適用性,已在多種來源的 EVs 中成功實(shí)現(xiàn)。此外,本研究還評(píng)估了 mEVs 作為藥物遞送載體的潛力,裝載了紫杉醇的 mEVs 在癌細(xì)胞內(nèi)展現(xiàn)出顯著的殺傷作用,有力證實(shí)了其作為藥物遞送載體的潛力。該技術(shù)不僅為 EVs 的細(xì)胞攝取和藥物遞送機(jī)制提供了重要理論依據(jù),還為基于 EVs 的靶向藥物遞送進(jìn)一步研究和應(yīng)用鋪平了道路。
發(fā)布者:廈門福流生物科技有限公司
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