在細(xì)胞外囊泡（EVs）的眾多來源中，牛奶來源的細(xì)胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）因其來源豐富、具有天然的生物活性和生物相容性等特性，被視為有潛力的下一代治療遞送平臺(tái)。mEVs 被開發(fā)用于口服藥物遞送的載體，保護(hù)治療藥物免受胃腸道降解，改善腫瘤的靶向治療。然而，要充分挖掘 mEVs 的治療潛力，需深入探究其細(xì)胞攝取行為及在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，這需要依賴可靠的標(biāo)記技術(shù)。目前，常用的熒光標(biāo)記方法存在諸多問題：例如，親脂性染料標(biāo)記存在染料脫落、自聚集、轉(zhuǎn)移以及影響囊泡完整性等問題；常用的共價(jià)標(biāo)記技術(shù)，如N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）酯染料標(biāo)記，需要借助蛋白表面的伯胺，可能會(huì)改變囊泡表面蛋白的功能；基因工程標(biāo)記則不適用于非培養(yǎng)來源的囊泡（如 mEVs），在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。因此，開發(fā)一種簡單、穩(wěn)定且對(duì)囊泡結(jié)構(gòu)和功能影響較小的標(biāo)記方法顯得尤為關(guān)鍵。

日前，集美大學(xué)陳超翔教授團(tuán)隊(duì)在 Small Methods 發(fā)表題為“Glycan-Anchored Fluorescence Labeling of Milk-Derived Extracellular Vesicles for Investigating Their Cellular Uptake and Intracellular Fate”的文章，報(bào)道了一種“聚糖錨定”熒光標(biāo)記策略。該策略通過氧化 mEVs 表面的唾液酸殘基，與熒光染料共價(jià)連接，從而實(shí)現(xiàn)對(duì) mEVs 的高效標(biāo)記。經(jīng)納米流式（NanoFCM）分析證實(shí)該方法的標(biāo)記效率近 100%，且 mEVs 的完整性和生物功能不受影響。這一創(chuàng)新的標(biāo)記技術(shù)為深入研究 mEVs 的細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及藥物遞送效率提供了有力的支持，有望推動(dòng)基于 mEVs 的新型藥物遞送系統(tǒng)的研發(fā)和臨床應(yīng)用。

01 聚糖錨定熒光標(biāo)記策略
研究者通過高碘酸鹽氧化 mEVs 表面的唾液酸產(chǎn)生醛基，再經(jīng)苯胺催化與含酰肼功能化的熒光團(tuán)（Cy5-酰肼）進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)熒光標(biāo)記（圖1a）。然后，利用 NanoFCM 對(duì)標(biāo)記后的 mEVs 進(jìn)行分析，熒光檢測(cè)顯示約 100% 的 mEVs 成功標(biāo)記了 Cy5，證實(shí)該方法具有極高的標(biāo)記效率（圖1c, d）。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記不影響 mEVs 的物理性質(zhì)、蛋白標(biāo)志物和細(xì)胞攝取能力，且在不同溫度和 pH 條件下穩(wěn)定性良好，對(duì)多種來源的 EVs 均適用（圖2）。
 

圖1. NanoFCM 評(píng)估聚糖錨定熒光標(biāo)記 mEVs 的效率