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文獻解讀:如何從體液中獲得真正細胞外囊泡取得的新突破

瀏覽次數:1632 發布日期:2023-1-31  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

由于細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)在疾病診斷以及治療領域的巨大潛力,被視為液體活檢和藥物遞送的明日之星。圍繞這些小囊泡的基礎研究持續升溫,在工業界亦是炙手可熱。但是,EVs的來源環境往往極其復雜,如細胞培養上清、血液、尿液以及腹水等生物體液,其自身在粒徑、組成成分等方面與雜質顆粒存在重疊,如何從復雜環境中純化得到高質量的EV樣本,一直是該領域面臨的重要挑戰。

目前在血漿等體液來源外泌體的研究中,差速離心結合密度梯度離心的方法是當前最廣泛使用的高純度外泌體分離方法。但該方法耗時長、操作繁瑣、難以平衡顆粒得率和產物質量且過高的離心力不可避免地對EV的完整性和組成成分造成不同程度的影響。因此,這些因素限制了該方法向臨床應用和工業界的轉化。

近日,來自德國馬爾堡大學腫瘤免疫研究中心的Strandmann教授團隊及合作者們在《J Extracellular Bio》上發表了題為“Isolation of native EVs from primary biofluids—Free-flow electrophoresis as a novel approach to purify ascites-derived EVs”的研究型文章,開發了一種從復雜的生物體液樣本中高效分離純化EVs的新方法。

 


 

由于磷脂雙層膜結構和表面高豐度的糖基化蛋白,EVs的表面電勢通常表現為負電勢(zeta電位),而脂蛋白及蛋白團聚體等雜質顆粒主要表現為正電勢;贓V與雜質顆粒的固有電荷密度或等電點的差異,作者利用自由流動電泳技術(free-flow electrophoresis, FFE),并通過優化分離純化緩沖液的pH值、分離介質、電導率和電壓等條件,開創性地發展了一種從富含蛋白顆粒及其他生物大分子的生物體液(如腹水)中高效純化EVs的方法。該方法具有分離通量高和速度快等優點,在6小時內即可完成100個樣本的分離純化,有望用于臨床樣本中EVs的分離,加速EVs的臨床應用轉化。
 


圖1. FFE設備原理概述及工作流程


如圖1所示,加載到樣品入口的預分離樣本通過縱向流運輸在垂直電場中分離。樣本中不同顆粒在電場內的遷移速度取決于它們的等電點和分離區分離緩沖液的pH值。同時,為了避免樣本接觸電極,作者使用了較高pH值的穩定緩沖液對電極進行包裹。待完成樣本的分離后,再使用相應緩沖液通過逆向流的方式將樣本的pH調整為中性。通過與分離室相連的毛細管,即可將分離后的各組分收集在96孔板中。隨后,作者以國際細胞外囊泡協會提出的MISEV為準繩,對所得的EVs樣本,從粒徑、濃度、純度、生化性質等多個維度進行了系統性評估。
 


圖2. 基于免疫印跡的FFE分離所得EV樣本的蛋白分析


首先,通過免疫印跡方法對腹水來源EVs的標志蛋白(ALIX和flotillin-1)、脂蛋白標準蛋白(如HDL標記物-ApoA和ApoE-乳糜微粒/VLDL標記物)以及囊泡常見污染物主要蛋白(calnexin)進行了分析。如圖2所示,ALIX和flotillin-1在分離得到的三個主要組分(F17-19)中被富集,而calnexin則完全沒有被檢測到。腹水中大量存在的脂蛋白ApoA、ApoE則用于評估最終EVs產品中的蛋白殘留情況。該方法完全去除了腹水樣本中高含量的Apo A蛋白。雖然在F18和F19中有檢測到Apo E,但也有研究發現Apo E與EV相關。
 


圖3. 基于電鏡及NanoFCM的EVs單顆粒表征


進一步采用TEM以及NanoFCM對純化所得樣本在單顆粒水平進行了分析(圖3)。TEM結果顯示,FFE法分離得到的EVs中沒有觀察到典型的蛋白質團聚體以及脂質顆粒等污染。NanoFCM則進一步揭示了EV經典標志蛋白CD9、CD63和CD81的表達情況,其中CD9的陽性比例最高,可達56.1%,CD81和CD63的陽性比例分別為19.8%和13.0%,而CD9和CD63雙陽性的比例僅為12%。作者還發現有15.2%的EVs表面有表達上皮細胞粘附分子EpCAM,提示該部分EVs可能來源于腫瘤細胞。NanoFCM進一步揭示四聯體跨膜蛋白陽性EVs的粒徑中位值為77 – 89 nm,而EpCAM陽性EVs的粒徑相對更大,中位值為95 nm。

結論
Strandmann教授團隊及其合作者結合免疫印跡、TEM和NanoFCM等多種表征方法,通過對FFE法進行優化,實現了從組成成分高度復雜的體液樣本中快速、高通量地分離純化得到EVs。結合NanoFCM檢測平臺,有望進一步實現EVs相關生物標志物的檢測,從基礎研究到臨床應用均展現出巨大潛力。

參考文獻
·Van Niel, G., Bergam, P., Di Cicco, A. et al.(2015). Apolipoprotein E regulates amyloid formation within endosomes of pigment cells. Cell Reports, 13, 43–51.

·Preußer, C., Stelter, K., Tertel, T. et al.(2022). Isolation of native EVs from primary biofluids—Free-flow electrophoresis as a novel approach to purify ascites-derived EVs. Journal of Extracellular Biology, 1, e71.

發布者:廈門福流生物科技有限公司
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