非洲豬瘟病毒P72蛋白抗體（單克隆抗體）在 ASF 防控中的應用
非洲豬瘟病毒（ASFV）的 P72 蛋白（由 B646L 基因編碼）是病毒最主要的結構蛋白，構成病毒粒子的衣殼，具有極高的保守性和免疫原性，是非洲豬瘟（ASF）診斷、病毒檢測及基礎研究的核心靶標之一。針對 P72 蛋白的抗體（尤其是單克隆抗體）在 ASF 防控中應用廣泛，以下從多維度詳細解析：
一、P72 蛋白的核心特征
- 維持病毒粒子的結構穩定性；
- 參與病毒對宿主細胞的識別與吸附；
- 作為病毒最保守的蛋白之一，在不同基因型 ASFV 中氨基酸序列同源性高達 90% 以上，是跨毒株檢測的理想靶標。
- 由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過二硫鍵連接，形成典型的 “Y” 型結構。
- 分子量約 150 kDa（IgG 型），其中重鏈約 50 kDa，輕鏈約 25 kDa。
- 可變區（V 區）：位于 “Y” 型頂端，由重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）組成，負責特異性識別 P72 蛋白的抗原表位（線性表位或構象表位），是抗體靶向結合的關鍵區域。
- 恒定區（C 區）：包括重鏈恒定區（CH1-CH3）和輕鏈恒定區（CL），決定抗體的類型（如 IgG1、IgG2a 等亞型）及效應功能（如結合 Fc 受體、激活補體等）。
- 單克隆抗體以 IgG 型為主（如小鼠 IgG1、IgG2b），因其穩定性強、親和力高，適合用于診斷試劑；
- 多克隆抗體多為兔源或羊源 IgG，可識別 P72 的多個表位，靈敏度更高。
- 基因 Ⅱ 型：全球主流流行株（如 Georgia 2007 株、我國流行的變異株）；
- 基因 Ⅰ 型：西非、歐洲經典株（如 L60 株、BA71V 株）；
- 其他基因型：基因 Ⅲ-ⅩⅧ 型（非洲地方性流行株）。
其跨毒株識別能力源于 P72 蛋白的高度保守性（不同基因型間氨基酸序列同源性 > 90%），是 ASF 通用診斷的核心依據。
1. 單克隆抗體制備
- 免疫原：通過原核表達（大腸桿菌）或真核表達（昆蟲細胞、HEK293）系統重組表達 P72 全長蛋白或優勢抗原片段（如第 1-300 位氨基酸），純化后作為免疫原。
- 雜交瘤構建：
- 用重組 P72 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾臟淋巴細胞；
- 與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）融合，通過 HAT 選擇培養基篩選雜交瘤細胞；
- 采用 ELISA、Western blot 等方法篩選能特異性結合 P72 蛋白的陽性克隆，經有限稀釋法克隆化，獲得穩定分泌抗體的細胞株。
- 抗體純化：從雜交瘤細胞上清或小鼠腹水（腹腔接種雜交瘤細胞）中，通過蛋白 A/G 親和層析純化，純度可達 95% 以上。
- 以重組 P72 蛋白免疫兔、羊等動物，定期采血收集抗血清；
- 用 P72 蛋白偶聯的親和層析柱純化血清，去除非特異性抗體，獲得多克隆抗體。其優勢是可識別多個表位，靈敏度高，但批次差異較大。
- 與 ASFV 的特異性結合：僅識別 ASFV 感染細胞或病毒粒子中的 P72 蛋白，不與其他豬源病毒（如豬瘟病毒、藍耳病病毒、偽狂犬病病毒等）發生交叉反應，確保診斷的專一性。
- 表位特異性：單克隆抗體通常針對 P72 蛋白的單一表位（如線性表位 “Gly120-Ser135” 或構象表位），多克隆抗體則覆蓋多個表位，可根據需求組合使用（如雙抗體夾心法中，捕獲抗體和檢測抗體針對不同表位，提高檢測特異性）。
- 與其他病毒的交叉率：極低（通常 < 0.1%），因 P72 蛋白是 ASFV 特有，與其他病毒無同源序列，故無交叉反應。
- 與不同 ASFV 毒株的交叉率：極高（通常 > 95%），由于 P72 蛋白高度保守，優質抗體可識別所有已知基因型毒株。僅當個別毒株的 P72 抗原表位發生罕見突變（如氨基酸替換）時，可能導致交叉率下降（但此類情況極少）。
- 親和力：單克隆抗體的親和力常數（Ka）通常為 10⁸-10¹⁰ L/mol，確保與 P72 蛋白的高效結合；
- 效價：ELISA 效價（終點稀釋倍數）可達 1:10⁶以上（單克隆抗體上清）或 1:10⁷以上（多克隆抗血清）；
- 穩定性：在 - 20℃可保存 2 年以上，4℃可穩定 6 個月，適合產業化應用。
- 診斷試劑：是 ASF 抗原檢測（如 ELISA、膠體金試紙條、熒光定量 PCR 配套抗體）和抗體檢測的核心試劑，可用于豬群篩查、病毒溯源；
- 基礎研究：通過免疫熒光、免疫電鏡定位 P72 蛋白在細胞內的分布，研究其在病毒組裝、入侵中的功能；
- 疫苗研發：作為評價候選疫苗免疫效果的指標（如檢測免疫豬群的抗 P72 抗體水平）。
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