非洲豬瘟病毒P54蛋白抗體抗體結構、對應毒株及制備方法
一、非洲豬瘟 P54 蛋白的背景
二、抗 P54 蛋白抗體的結構
1. 單克隆抗體制備
- 基本結構：由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過二硫鍵連接形成 “Y” 型免疫球蛋白結構。
- 功能區域：
- 可變區（V 區）：位于 “Y” 型頂端，由重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）組成，負責特異性識別 P54 蛋白的抗原表位（線性或構象表位），是抗體靶向結合的核心區域。
- 恒定區（C 區）：包括重鏈恒定區（CH1-CH3）和輕鏈恒定區（CL），決定抗體的類型（如 IgG、IgM 等）和效應功能（如激活補體、結合 Fc 受體等）。
- 常見類型：應用中以 IgG 型單克隆抗體為主，因其穩定性高、親和力強，適合用于診斷試劑開發和實驗室檢測。
- 基因 Ⅱ 型：目前在我國及全球廣泛流行的主流毒株（如 Georgia 2007 株及其變異株）。
- 基因 Ⅰ 型：西非、歐洲部分地區流行的毒株（如 L60 株、BA71V 株）。
- 其他基因型毒株：如基因 Ⅲ 型至 ⅩⅧ 型（覆蓋非洲、歐洲等地流行株），由于 P54 蛋白序列變異較小，抗體對多數毒株均有交叉識別能力，但具體識別范圍需通過實驗驗證（如針對變異位點的抗體可能對特定毒株識別能力下降）。
1. 單克隆抗體制備
- 免疫原制備：通過原核表達系統（如大腸桿菌）或真核表達系統（如昆蟲細胞、HEK293 細胞）重組表達 P54 蛋白（全長或優勢抗原表位片段），經純化后作為免疫原。
- 雜交瘤細胞構建：
- 用重組 P54 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾臟淋巴細胞，與骨髓瘤細胞（如 SP2/0）融合，通過有限稀釋法篩選能穩定分泌抗 P54 抗體的雜交瘤細胞株。
- 抗體純化：從雜交瘤細胞培養上清或小鼠腹水（腹腔接種雜交瘤細胞獲得）中，采用蛋白 A/G 親和層析、離子交換層析等方法純化，獲得高純度單克隆抗體。
- 以重組 P54 蛋白免疫兔、羊等動物，定期采血分離血清，通過親和層析去除非特異性抗體，獲得多克隆抗體。其優勢是可識別 P54 蛋白的多個抗原表位，靈敏度較高，但特異性略低于單克隆抗體。
- 與 ASFV 的特異性結合：能特異性識別 ASFV 感染細胞中的 P54 蛋白或病毒粒子，不與其他豬源病毒（如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒等）發生交叉反應，這是其用于 ASF 特異性診斷的核心基礎。
- 表位特異性：單克隆抗體通常針對 P54 蛋白的單一抗原表位（如特定氨基酸序列組成的線性表位，或依賴空間結構的構象表位），多克隆抗體則可識別多個表位，因此在檢測中可根據需求組合使用（如單克隆抗體用于精準定性，多克隆抗體用于提高檢測靈敏度）。
- 與其他病毒的交叉反應：由于 P54 蛋白是 ASFV 特有的蛋白，且與其他病毒的蛋白序列同源性極低，抗 P54 抗體與其他豬病毒的交叉反應率極低（通常 < 1%），確保了診斷的特異性。
- 與不同 ASFV 毒株的交叉反應：因 P54 蛋白在 ASFV 各毒株中保守性較高（氨基酸序列同源性通常 > 90%），優質抗 P54 抗體對不同基因型毒株的交叉反應率較高（一般 > 85%），可覆蓋全球主流流行毒株。但需注意，少數變異毒株若在 P54 蛋白的抗原表位區域發生突變，可能導致交叉反應率下降，因此需結合當地流行毒株的序列進行驗證。
- 診斷試劑開發：用于 ASF 的血清學檢測（如 ELISA 檢測抗體）或病毒抗原檢測（如免疫熒光試驗、膠體金試紙條、免疫組化），是 ASF 快速篩查和確診的重要工具。
- 病毒學研究：通過抗體標記技術（如免疫熒光、免疫電鏡）定位 P54 蛋白在細胞內的分布，研究其在病毒復制周期中的功能；或用于病毒中和試驗，探索其在抑制病毒感染中的作用。
- 疫苗評價：作為免疫應答指標，通過檢測抗 P54 蛋白抗體水平，評估候選疫苗誘導的體液免疫效果。
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