抗經典豬瘟單克隆抗體抗體結構、靶向抗原、制備流程及應用參數
一、抗體結構特征
- 整體結構：由 2 條重鏈（H 鏈，約 50 kDa）和 2 條輕鏈（L 鏈，約 25 kDa）通過二硫鍵連接形成 “Y” 型結構，分子量約 150 kDa（IgG）。
- 功能區域：
- 可變區（V 區）：重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）組成抗原結合位點（CDR1-CDR3），負責特異性識別 CSFV 抗原的線性或構象表位（E2 蛋白的中和表位多為構象表位，依賴蛋白空間結構）。
- 恒定區（C 區）：重鏈恒定區（CH1-CH3）決定抗體效應功能（如 IgG2a 的 Fc 段可介導補體依賴的細胞毒性（CDC）或調理作用），輕鏈恒定區（CL）輔助維持結構穩定。
- 修飾特征：部分單抗的 Fc 段存在 N - 糖基化修飾，影響抗體在體內的半衰期（若用于被動免疫）和與 Fc 受體的結合能力。
- E2 蛋白：全長約 370 個氨基酸，含多個中和表位（如 A、B、C、D 表位），其中 A 表位（位于 N 端）是中和活性的核心區域，多數具有中和功能的單抗靶向此表位。E2 蛋白高度保守（不同毒株間同源性約 80%-95%），但疫苗株與野毒株的表位可能存在細微差異（可用于區分免疫與感染）。
- 其他抗原：少數單抗靶向 E0 蛋白（參與病毒釋放）或 Core 蛋白（用于病毒核酸檢測的輔助驗證），但因 E0 和 Core 的免疫原性較弱，應用范圍較窄。
- 疫苗株：C 株（兔化弱毒疫苗，2.1 亞型，E2 蛋白序列穩定，是單抗制備的常用免疫原）、HCLV 株（豬瘟兔化弱毒疫苗）。
- 野毒株：石門株（強毒，1.1 亞型）、Alfort 株（1 型）、Brescia 株（1 型）、GLV 株（2 型）等。
- 重組抗原：通過桿狀病毒 - 昆蟲細胞、CHO 細胞表達的重組 E2 蛋白（保留天然構象，含完整中和表位），是單抗制備的首選免疫原（純度高、安全性好）。
1. 制備步驟
- 免疫原制備：優先選擇重組 E2 蛋白（純度≥95%，濃度 50-100μg / 劑，需驗證構象表位完整性），或滅活 CSFV 病毒（滴度≥10⁶ TCID₅₀/mL，需無殘留毒力）。
- 動物免疫：BALB/c 小鼠腹腔免疫，基礎免疫 3 次（間隔 2 周），加強免疫 1 次（融合前 3 天），血清效價需≥1:10⁴（間接 ELISA 檢測，以重組 E2 蛋白為包被抗原）。
- 細胞融合：取免疫小鼠脾臟 B 淋巴細胞與 SP2/0 骨髓瘤細胞融合，融合率≥30%，雜交瘤克隆形成率≥50%。
- 篩選與克隆：
- 初篩：間接 ELISA（檢測針對重組 E2 蛋白的抗體）。
- 復篩：免疫熒光（IFA，檢測感染 CSFV 的 PK-15 細胞中的特異性熒光）、中和試驗（檢測對活病毒的中和活性，中和效價≥1:16 為陽性）。
- 克隆純化：有限稀釋法克隆 3 次以上，確保單克隆性（染色體數目穩定，約 90-110 條）。
- 抗體生產：腹水誘生（效價 1:10⁶-10⁸）或無血清懸浮培養（濃度 20-100μg/mL），經 Protein A/G 親和純化后純度≥95%。
- 雜交瘤穩定性：連續傳代 60 次后，抗體分泌能力無顯著下降（效價波動≤20%）。
- 抗體效價：ELISA 效價（腹水）≥1:10⁶，中和效價（針對強毒株）≥1:32。
1. 特異性
- 抗原特異性：僅與 CSFV 的靶抗原（如 E2）結合，不識別 CSFV 的非結構蛋白（如 NS3、NS5）或其他病毒（如豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV、豬偽狂犬病病毒 PRV）的抗原。
- 病毒特異性：通過 IFA 和中和試驗驗證，僅與 CSFV 反應，不與同屬的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）交叉反應（因三者 E2 蛋白存在部分同源序列，需嚴格排除交叉）。
- 與同屬病毒：優質單抗對 BVDV、BDV 的交叉反應率≤5%（ELISA 檢測 OD 值比值 < 0.05）。
- 與不同基因型 CSFV：因 E2 蛋白保守性高，單抗通�？山徊孀R別 1-3 型毒株，對 1 型和 2 型毒株的識別率≥90%，對 3 型的交叉率≥85%。
- 區分疫苗株與野毒株：部分單抗可識別野毒株特有的表位（如石門株的 D 表位），對疫苗株（C 株）無反應，交叉率≤1%，可用于 “鑒別診斷（DIVA）” 試劑。
- 親和力：通過 SPR（表面等離子體共振）或 ELISA 競爭法測定，解離常數（KD）通常為 10⁻⁸-10⁻¹⁰ M（KD 值越小，親和力越高，中和活性越強）。
- 中和活性：在細胞水平可有效抑制 CSFV 感染，50% 抑制濃度（IC₅₀）≤1μg/mL（針對 100 TCID₅₀的病毒）。
- 熱穩定性：37℃放置 7 天，效價保留率≥80%；-20℃凍存 3 年，活性無顯著下降。
- 應用適應性：適用于 ELISA（檢測抗原或抗體）、IFA（病毒定位）、Western blot（僅識別變性抗原的單抗）、病毒中和試驗等，工作濃度范圍：ELISA 1:2000-1:10000，IFA 1:500-1:2000。
- 診斷試劑：作為核心試劑用于 CSFV 抗原檢測（如雙抗體夾心 ELISA）、病毒分型及 “免疫 - 感染” 鑒別診斷。
- 基礎研究：解析 E2 蛋白的功能（如與宿主細胞受體結合機制）、病毒入侵途徑。
- 被動免疫：高中和活性的單抗可用于仔豬緊急預防或發病豬的早期治療（需驗證安全性和半衰期）。
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