單細胞RNA測序（scRNA-seq）是一項突破性技術，極大地提高了研究生物系統的分辨率。現在可以將復雜的組織分解成它們各自的細胞類型，并了解它們的基因表達模式。此外，現在不僅可以表征細胞群之間的異質性，而且可以表征細胞內的異質性，通常這會對定義細胞類型的概念提出挑戰。scRNA-seq技術已迅速成熟，但經常是封閉的商業系統或需要專門的設備。最近， 瑞典Karolinska研究所的HagemannJensen博士及其同事報告了Smart-seq3技術的開發，這使得通用的Smart-seq化學方法更新迭代。

與Smart-seq2相比，Smart-seq3的靈敏度大大提高，通常每個細胞可檢測數千個基因。此外，該協議現在實現了涵蓋全長度記錄副本和5’UMI標記的獨特混合方法。這樣既可以進行精確的定量mRNA測量，又可以保留覆蓋全長度的獨特能力，以研究其他剪接異構體和表達遺傳變異。

實際上，Smart-seq3庫可以通過相對便宜的試劑成本生成，且不需要特定于平臺的設備。然而，通過集成Formulatrix的MANTIS®液體處理器（圖1），可以自動執行Smart-seq3協議的大多數操作步驟，以提高通量，減少死體積并減少移液步驟，降低移液器吸頭成本。

圖 1: MANTIS液體處理器

在本應用指南中，我們將演示在庫準備工作流程中，使用MANTIS的關鍵步驟。

Smart-seq3是一種獨特的全長度定量scRNA -seq協議。

Smart-seq3利用既定的96孔及384孔微孔板塊進行庫準備。首先，單細胞需要被分離并放置到含有裂解緩沖液的孔中。

通常情況下，將通過FACS技術進行篩選，大多數實驗室都可以通過其核心設備來實現，也可以通過顯微解剖或激光捕獲。直到進一步處理前，裂解板可以-80°C保存。首先，mRNA將被反向轉錄，第一鏈cDNA模板與含有umi的5 ‘寡核苷酸(TSO)進行交換。然后，用PCR進行全長cDNA擴增，擴增后的cDNA用磁珠純化。通過這種純化，使用熒光DNA結合染料對cDNA進行定量，以便準確地使整個板上的cDNA濃度標準化。標準化cDNA的一部分，采用標記法和PCR法，進行庫準備工作。在匯集所有索引庫DNA后，可以在任何傳統的Illumina平臺上執行測序。

Smart-seq3協議是完全開源的，所有深入步驟和試劑數量都已存儲在協議中。

使用MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片有效分配試劑

單細胞RNA-seq庫制備的關鍵目標是在擴增前避免mRNA分子丟失。從理論上講，損失可能發生，核酸可能被吸附在實驗室通用塑料的表面，如移液管吸頭。利用MANTIS的非接觸分配，消除手動液體處理步驟，從而避免了這個潛在的問題。此外，快速分配速度最大限度地減少了逆轉錄之前所花費的時間，甚至可以將保持板與兼容冷塊結合，獲得最佳的樣本溫度。另一方面，非接觸式分配也減少了吸頭的支出，每384孔板的用量相當可觀。此 外，MANTIS低容量(LV)和高容量(HV)芯片的低死體積節省了寶貴的試劑用量 (圖2)。

圖2：憑借MANTIS的低死體積，及用移液管吸頭直接裝載試劑和，保證了最少的試劑浪費，例如分配逆轉錄母料混合物。

使用MANTIS持續流量（CF)，易于測量濃度和標準化。

在成功生成預擴增的cDNA庫后(圖3)，Smart-seq3的研究人員運用可選步驟，在濃度標準化后確定所有擴增庫的DNA濃度。

圖3:在安捷倫生物分析儀上運行的一個成功的Smart-seq3 cDNA庫的例子。

在最終庫準備步驟時輸入相同的DNA濃度，確保了更好的下游均勻性和序列質量。通過利用MANTIS 的持續流量功能，將大量染色的熒光DNA溶液分配 至適合熒光強度測量的黑色微孔板。在獲得并計算出每孔中的cDNA濃度之后，創建Excel或 OpenOffice電子表格計算出所需要的不同水量，將cDNA調整到設定的濃度。這一步驟可以在已經裝有預擴增庫的孔板上完成，也可以使用新的孔板。MANTIS的另一個獨特之處在于，可以直接導入包含整個孔板的體積分配值的電子表格(圖4)。MANTIS軟件允許實時計算和自動創 建分配列表，包括根據直接從微波微流控孔板讀取器的輸出中導入并標準化的濃度測量。這 使得不同的體積液體可以被快速且準確地分配到每一個384孔板中。CF或HV芯片都可以用來 分配這些不同的體積。

圖4:標準化cDNA濃度的分配布局，可以通過電子表格計算將需要分配的不同水量導入MANTIS軟件，也可以使用內置的標準化向導程序直接導入孔板讀取器的輸出值。

可負擔得起的測序庫
為了創建測序準備庫，Smart-seq3依賴轉位子Tn5將預擴增的cDNA切成更小的片段。在酶裂解過程中，Tn5酶將預先裝載的寡糖插入切割位點，從而實現雙索引PCR。考慮到在該方法中應用的反應體積的穩健小型化，使用MANTIS分配試劑及標記反應及后續PCR所需的酶。這大大降低了變異性，也降低了Tn5酶絕對反應的成本。

總的來說，在scRNA-seq工作流程中使用MANTIS，大大減少了所需的塑料噴嘴損耗數量。從開始到結束，減少至少8盒384孔移液噴嘴使用量，通常會為用戶節省250至400歐元。此外，MANTIS將工作體積、成本顯著降低到每個細胞0.5-1.0歐元。

使用Smart-seq3進行高質量的轉錄組測量
在完成庫準備工作流程后，Smart-seq3兼容任何通用 Illumina測序平臺。卡羅林斯卡研究所的研究人員通過 HEK293T細胞實驗，證明了他們的單細胞RNA測序方法的高質量。在平均測序深度為180萬reads的下，質量數據現實，大部分的基因讀長證明了人類參考基因組的外顯子和內含子區域，與成熟和新生的mRNA存在一致( 圖5)。此外，庫的準備工作對檢測RNA分子表現出極高的敏感性，從而檢測到大量基因。

圖5：典型的Smart-seq3實驗質量統計。在384 孔板中對HEK293T細胞進行解碼，平均測序深度為每個細胞180萬reads。

卡羅林斯卡學院的研究人員表明，在工作流程中使用 MANTIS，用Smart-seq3從單細胞中創建測序庫，是一種獲得高質量、高通量、高重復性的好方法，同時又減少人工勞動、塑料品消耗和總成本。此外，MANTIS技術展示了應用于其他現有的單細胞RNA測序方法的潛力及多功能性，并有助于開發新的研究方法。

致謝
富默樂要感謝Christoph Ziegenhein和Michael Hagemann- Jensen以及Karolinska研究所的同事，感謝他們在評估MANTIS分液技術在Smart-seq3 流程中運用的做出的貢獻，以及在此應用說明中提供的證明結果。