I. 介紹

本實驗步驟描述了如何在MANTIS®液體處理器上使用SMART-Seq單細胞試劑盒(SSsc Kit, Cat)在96-孔板 上從單個細胞中生成cDNA (SSsc kit, Cat. # 634472)。

II. 概論

• 一個96-反應(yīng)試劑盒提供了足夠的試劑來執(zhí)行這個實驗方案。為了確保試劑有足夠的數(shù)量進行96個全體 積反應(yīng)，請務(wù)必遵守LV、HV芯片的灌注和預(yù)分配體積:

• LV芯片灌注體積= 5.4 μl

• LV芯片預(yù)分配體積為=1.2 μl

• HV芯片灌注體積=12 μl

• HV芯片預(yù)分配體積=5 μl 

• 每一個新的添加物使用一個新的芯片。在一天運行結(jié)束后，按照相應(yīng)的洗滌步驟清洗所有LV和HV芯片。

• 注意避免在整個過程中出現(xiàn)氣泡。

• 有關(guān)SMART-Seq單細胞套件的更多信息，請參閱SMART-Seq單細胞套件用戶手冊。

III. 實驗步驟

A. 用于細胞分選的96孔板的制備

1. 為了制作CDS分選溶液(CSS)，首先手動注入114μl 10X裂解緩沖液到1.5 ml無核酸酶管中。

2. 添加6μl核糖核酸酶抑制劑(40 U /μl)，通過緩慢混合后快速旋轉(zhuǎn)試劑。

3. 加入120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A

4. 加1,260μl無核酸酶水(總體積1,500μl)。

5. 緩慢旋轉(zhuǎn)混合物。

6. 將750μl的CSS注入兩個1000μl的吸管剪短，并將尖端裝入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通過對 MANTIS液體處理器編寫程序，從選擇的位置添加3.2μl CSS到每個孔中。(每個孔將得到兩份6.3 μl當(dāng)量的CSS)

注:在本實驗方案中，我們假設(shè)FACS對細胞的分選不會改變板孔中液體的體積。如果分選機分配了不可忽略體積的鞘液量，可通過減少無核酸酶水的量來調(diào)整CSS混合物的體積，使其總體積保持在12.6μl /孔。

安全停止點：孔板可在-20°C保存過夜。

B. 細胞分類

1. 將細胞直接注入含有CSS的板孔中。

2. 分類完成后，將孔板密封，并將其快速旋轉(zhuǎn)，使細胞到達孔的底部。

3. 立即將孔板放置于干冰上約5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到-80°C的冰箱。

安全停止點：孔板可在-80°C保存過夜。

C. 低聚糖退火

1. 從-80°C的冰箱中取出孔板，讓它解凍約1分鐘，并輕微旋轉(zhuǎn)。然后，向下旋轉(zhuǎn)孔板，收集孔底的 內(nèi)容物。

2. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中，在72°C孵化3分鐘

3. 孵化3分鐘后，放置到冰塊上2分鐘。

4. 當(dāng)孔板放在冰上時，準備RT反應(yīng)混合液(D部分)。

D. RT反應(yīng)混合液的制備

1. 將下列試劑按如下順序室溫添加到1.5 ml無核酸酶管中，制備足夠的RT反應(yīng)混合物，進行96次 反應(yīng)。務(wù)必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆轉(zhuǎn)錄酶，上下輕輕混合。

*該圖表詳細說明了每種成分進行96次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量)，包括以計算移液誤差的補充體積。

2. 在1,000 μl的移液管頂端加入795μl的RT反應(yīng)混合也，裝入LV MANTIS 芯片上(位置3)。用MANTIS液體處理器編程，將7.5μl的RT反應(yīng)混合液加入到選擇的孔中。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60 秒。

E. 第一鏈的合成

1. 將孔板從D部分轉(zhuǎn)移到一個預(yù)熱的熱循環(huán)器中，并運行以下程序 :

2. 程序完成后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)平板30-60秒。

安全停止點：孔板可在4°C保存過夜。

F. PCR擴增cDNA

1. 將以下試劑按照順序加入到15 ml冰管中，準備足夠的96個反應(yīng)的PCR反應(yīng)混合液。請務(wù)必在使 用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下輕輕混合。

*該圖表詳細說明了每種成分進行96次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量)，包括以計算移液誤差的補充體積。

2. 在3個1000μl的移液管吸頭加入1080μl PCR主混合液，將每個吸頭裝入HV MANTIS 芯片(位置 4-6)。每1000μl的移液器吸頭，使用MANTIS液體處理器編程，在E階段制備的孔板每孔中加入 10μl的PCR主混合液。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60 秒。

4. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中，運行以下程序:

*使用以下表格作為指導(dǎo)，以幫助確定輸入的最佳PCR循環(huán)次數(shù):

5. 如下一階段(階段G)所示，可以使用Agencourt AMPure XP磁珠手工純化cDNA。

安全停止點：孔板可在4°C保存過夜。

G. 用Agencourt AMPure XP試劑盒純化擴增的cDNA

1. 每次使用前，取適量置于室溫下至少30分鐘，攪拌均勻即可。

2. 每次實驗準備新鮮的80%乙醇。每個樣品需要400μl。

3. 需要一個能容納96孔板的磁力分離架。

4. 旋轉(zhuǎn)AMPure XP磁珠混合均勻，然后在每個樣品中加40μl。

5. 通過輕輕旋轉(zhuǎn)或上下?lián)u晃移液至少10次，徹底混合。

6. 室溫孵化8分鐘，讓cDNA與磁珠結(jié)合。

7. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約5分鐘或更長時間，直 至液體完全清澈，上清液中無磁珠殘留。

8. 當(dāng)樣品放在磁力分離架上時，用移液管移去上清液并丟棄。

9. 把樣品放在磁力分離架上。每個樣品添加50μl新鮮配制的80%乙醇，不干擾磁珠。等待30秒后， 小心移去含有污染物的上清液。在清洗過程中， cDNA將繼續(xù)結(jié)合在磁珠上。

10. 重復(fù)乙醇清洗(步驟9)一次。

11. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。

12. 在室溫下放置樣品約2-2.5分鐘，直到顆粒不再有光澤，但在裂紋出現(xiàn)之前。

13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脫緩沖液蓋住磁珠。從磁力分離架中取出樣品，徹底混合，重新懸浮磁珠。

14. 室溫孵化2分鐘以補水。

15. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約1分鐘或更長時間，直 至液體完全清澈。

16. 含有純化cDNA的上清液從每個孔轉(zhuǎn)移到無核酸酶，低粘附力的管中。在每個試管上貼上樣品信 息標(biāo)簽，并在-20°C保存，直到庫準備好。

安全停止點：孔板可在-20°C保存過夜。

17. 參考SMART-Seq Single Cell Kit用戶手冊，了解量化和庫準備選項。