一、HPT 的分子結構與生物學功能

觸珠蛋白（Haptoglobin, HPT），又稱結合珠蛋白，是一種由肝臟合成的急性時相反應蛋白，主要功能是結合游離血紅蛋白（Hb），防止腎臟損傷并回收鐵離子。其關鍵特征包括：

分子量：約 85-100 kDa（因基因型差異而異）；

結構：由 α 鏈（α1 或 α2）和 β 鏈通過二硫鍵連接形成四聚體，人類中主要存在三種表型：

HPT 1-1 型：α1 鏈（α1⁰，分子量約 16 kDa）與 β 鏈（27 kDa）組成（α1β）₂；

HPT 2-1 型：α1 鏈與 α2 鏈（α2，分子量約 32 kDa）混合組成（α1α2β₂）多聚體；

HPT 2-2 型：僅含 α2 鏈，形成（α2β）₂多聚體；

基因定位：α 鏈基因（HP1 和 HP2）位于染色體 16q22.1，β 鏈基因（HPB）與 α 鏈連鎖。
 

二、HPT 抗原的制備方法

（一）天然提取法（從人血清）

原料預處理：

采集新鮮人血清（EDTA 抗凝），56℃滅活 30 分鐘以破壞補體，4℃離心（3000×g，10 分鐘）去除沉淀。

純化流程：

硫酸銨沉淀：血清中加入 40% 飽和度硫酸銨，4℃靜置 2 小時，離心（10000×g，20 分鐘）收集沉淀，用 PBS（pH 7.4）溶解；

親和層析：通過血紅蛋白 - 瓊脂糖柱（Hb-Sepharose）純化，利用 HPT 與 Hb 的高親和力（KD≈10⁻⁹ M），用 0.1 M NaCl 洗脫結合的 HPT；

凝膠過濾：經 Sephadex G-200 層析去除雜蛋白，收集分子量 85-100 kDa 的洗脫峰，超濾濃縮至 1-5 mg/mL。

關鍵參數：

得率：每升血清約提取 50-100 mg HPT，純度 > 90%（SDS-PAGE 驗證）；

活性保留：天然 HPT 需避免極端 pH（<5.0 或> 9.0）和高溫（>50℃），以防 Hb 結合位點變性。

（二）重組表達法（基因工程技術）

表達系統選擇：

哺乳動物細胞（CHO 細胞）：可實現糖基化修飾，更接近天然 HPT 構象，推薦表達 α1β 或 α2β 單體；

載體構建：克隆 α 鏈和 β 鏈基因（含信號肽），插入雙順反子載體（如 pIRES），共轉染 CHO 細胞；

純化步驟：Protein A 親和層析（若融合 IgG Fc 標簽）→離子交換層析（Q-Sepharose）→疏水層析（Phenyl-Sepharose）。

表達效率：

懸浮培養 CHO 細胞表達量約 10-20 mg/L，純度 > 95%，需通過 Western blot 驗證 α/β 鏈組裝。
 

三、HPT 抗原的偶聯與免疫原性

載體蛋白偶聯（用于抗體生產）：

偶聯方法：

EDC/NHS 法：適用于 HPT 羧基與 BSA/OVA 氨基交聯，優化條件為 HPT:BSA（1:5，mg/mg），EDC 濃度 5 mM，室溫反應 2 小時；

戊二醛法：雙功能交聯劑，需控制戊二醛濃度（0.1-0.5%），避免過度交聯導致抗原表位遮蔽；

偶聯比測定：

紫外分光法：計算 280 nm 處 HPT（ε=1.4 mL/mg・cm）與 BSA（ε=0.66 mL/mg・cm）的吸光度，理想分子比為 3-5:1；

SDS-PAGE 遷移率偏移：偶聯物分子量應 > 150 kDa（BSA 分子量 66 kDa，HPT 約 90 kDa）。

抗原表位分析：

主要免疫原性區域位于 α 鏈 N 端（氨基酸 1-50）和 β 鏈 C 端（氨基酸 200-250），其中 α2 鏈特有的重復序列（如 Pro-Pro-Val-Leu）為 HPT 2-2 型特異性表位；

天然 HPT 的糖基化（N - 糖基化位點位于 α 鏈 Asn38 和 β 鏈 Asn154）可增強抗體識別效率。
 

四、HPT 的電泳特性與生化參數

SDS-PAGE 分析：

還原條件下：α1 鏈（16 kDa）、α2 鏈（32 kDa）和 β 鏈（27 kDa）分離；

非還原條件下：形成（αβ）₂四聚體（85 kDa）或（α2β）₂多聚體（100 kDa），HPT 2-1 型可見多條分子量介于 85-100 kDa 的條帶（混合多聚體）。

等電聚焦（IEF）：

pI 約 4.5-5.5（因糖基化程度而異），酸性蛋白，電泳時向陽極遷移，可與堿性蛋白（如白蛋白 pI 4.7）區分。

功能活性檢測：

Hb 結合能力：ELISA 法測定 HPT 與 Hb 的結合活性，飽和結合量為 1 mg HPT 結合 0.8 mg Hb，KD 值≈5×10⁻¹⁰ M；

溶血抑制實驗：體外測定 HPT-Hb 復合物對紅細胞的保護作用，50% 溶血抑制濃度（IC₅₀）約 10-20 μg/mL。
 

五、HPT 的臨床檢測與應用參數

作為急性時相標志物：

血清正常參考范圍：成人 0.5-2.0 g/L（不同表型略有差異），兒童 0.3-1.5 g/L；

病理升高：感染、創傷、腫瘤時可升高 2-5 倍，半衰期約 3-5 天；

病理降低：溶血性貧血（HPT 與游離 Hb 結合消耗）、肝病（合成減少）、先天性 HPT 缺乏癥（罕見，發病率約 1/10 萬）。

檢測方法學：

免疫比濁法：自動化生化分析儀（如 Roche Cobas c701），檢測范圍 0.1-5.0 g/L，批內 CV<5%；

ELISA：雙抗體夾心法（包被抗 α 鏈單抗，檢測抗 β 鏈多抗），靈敏度 < 10 mg/L，適用于低濃度樣本（如尿液）；

基因型檢測：PCR-RFLP 法區分 HP1 和 HP2 基因，HPT 2-2 型與糖尿病腎病風險相關。

臨床應用場景：

溶血性疾病鑒別：血清 HPT 降低伴游離 Hb 升高提示血管內溶血（如瘧疾、輸血反應）；

肝病評估：慢性肝炎或肝硬化時 HPT 合成下降，與肝損傷程度正相關；

炎癥監測：動態監測 HPT 水平可評估感染性疾病（如膿毒癥）的預后。
 

六、HPT 與其他溶血標志物的對比

標志物 檢測樣本 臨床優勢 局限性

HPT 血清 / 血漿 特異性結合 Hb，反映血管內溶血 受肝臟合成影響

游離 Hb 血漿 直接反映溶血程度 半衰期短（<1 小時）

乳酸脫氫酶（LDH） 血清 非特異性溶血指標，普及性高 多種組織損傷均可升高
 

七、HPT 的生物學功能延伸

抗氧化與抗炎作用：

HPT-Hb 復合物可清除游離血紅素介導的氧化應激，減少羥基自由基生成；

抑制中性粒細胞活化，下調炎癥因子（如 TNF-α、IL-6）釋放。

鐵代謝調控：

結合 Hb 后被肝巨噬細胞（Kupffer 細胞）通過 CD163 受體內吞，促進鐵回收（每分子 HPT-Hb 復合物可回收 4 個 Fe²⁺）；

與鐵調素（Hepcidin）協同調節血清鐵水平，在貧血伴炎癥時發揮關鍵作用。
 

八、總結

觸珠蛋白作為急性時相蛋白，其抗原制備以天然提取為主，重組表達需關注 α/β 鏈的正確組裝。電泳特性可用于表型分析，而免疫比濁法是臨床檢測的金標準。HPT 在溶血與炎癥疾病中的雙重角色，使其成為連接血液學與肝病學的重要生物標志物，未來基于 HPT-Hb-CD163 通路的治療策略可能為溶血性疾病提供新方向。