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觸珠蛋白 / 結(jié)合珠蛋白(HPT-Ag)的全面解析:結(jié)構(gòu)、制備與免疫特性

瀏覽次數(shù):299 發(fā)布日期:2025-6-19  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責任自負
一、HPT 的分子結(jié)構(gòu)與生物學功能
觸珠蛋白(Haptoglobin, HPT),又稱結(jié)合珠蛋白,是一種由肝臟合成的急性時相反應蛋白,主要功能是結(jié)合游離血紅蛋白(Hb),防止腎臟損傷并回收鐵離子。其關鍵特征包括:
分子量:約 85-100 kDa(因基因型差異而異);
結(jié)構(gòu):由 α 鏈(α1 或 α2)和 β 鏈通過二硫鍵連接形成四聚體,人類中主要存在三種表型:
HPT 1-1 型:α1 鏈(α1⁰,分子量約 16 kDa)與 β 鏈(27 kDa)組成(α1β)₂;
HPT 2-1 型:α1 鏈與 α2 鏈(α2,分子量約 32 kDa)混合組成(α1α2β₂)多聚體;
HPT 2-2 型:僅含 α2 鏈,形成(α2β)₂多聚體;
基因定位:α 鏈基因(HP1 和 HP2)位于染色體 16q22.1,β 鏈基因(HPB)與 α 鏈連鎖。
 
二、HPT 抗原的制備方法
(一)天然提取法(從人血清)
原料預處理:
采集新鮮人血清(EDTA 抗凝),56℃滅活 30 分鐘以破壞補體,4℃離心(3000×g,10 分鐘)去除沉淀。
純化流程:
硫酸銨沉淀:血清中加入 40% 飽和度硫酸銨,4℃靜置 2 小時,離心(10000×g,20 分鐘)收集沉淀,用 PBS(pH 7.4)溶解;
親和層析:通過血紅蛋白 - 瓊脂糖柱(Hb-Sepharose)純化,利用 HPT 與 Hb 的高親和力(KD≈10⁻⁹ M),用 0.1 M NaCl 洗脫結(jié)合的 HPT;
凝膠過濾:經(jīng) Sephadex G-200 層析去除雜蛋白,收集分子量 85-100 kDa 的洗脫峰,超濾濃縮至 1-5 mg/mL。
關鍵參數(shù):
得率:每升血清約提取 50-100 mg HPT,純度 > 90%(SDS-PAGE 驗證);
活性保留:天然 HPT 需避免極端 pH(<5.0 或> 9.0)和高溫(>50℃),以防 Hb 結(jié)合位點變性。
(二)重組表達法(基因工程技術)
表達系統(tǒng)選擇:
哺乳動物細胞(CHO 細胞):可實現(xiàn)糖基化修飾,更接近天然 HPT 構(gòu)象,推薦表達 α1β 或 α2β 單體;
載體構(gòu)建:克隆 α 鏈和 β 鏈基因(含信號肽),插入雙順反子載體(如 pIRES),共轉(zhuǎn)染 CHO 細胞;
純化步驟:Protein A 親和層析(若融合 IgG Fc 標簽)→離子交換層析(Q-Sepharose)→疏水層析(Phenyl-Sepharose)。
表達效率:
懸浮培養(yǎng) CHO 細胞表達量約 10-20 mg/L,純度 > 95%,需通過 Western blot 驗證 α/β 鏈組裝。
 
三、HPT 抗原的偶聯(lián)與免疫原性
載體蛋白偶聯(lián)(用于抗體生產(chǎn)):
偶聯(lián)方法:
EDC/NHS 法:適用于 HPT 羧基與 BSA/OVA 氨基交聯(lián),優(yōu)化條件為 HPT:BSA(1:5,mg/mg),EDC 濃度 5 mM,室溫反應 2 小時;
戊二醛法:雙功能交聯(lián)劑,需控制戊二醛濃度(0.1-0.5%),避免過度交聯(lián)導致抗原表位遮蔽;
偶聯(lián)比測定:
紫外分光法:計算 280 nm 處 HPT(ε=1.4 mL/mg・cm)與 BSA(ε=0.66 mL/mg・cm)的吸光度,理想分子比為 3-5:1;
SDS-PAGE 遷移率偏移:偶聯(lián)物分子量應 > 150 kDa(BSA 分子量 66 kDa,HPT 約 90 kDa)。
抗原表位分析:
主要免疫原性區(qū)域位于 α 鏈 N 端(氨基酸 1-50)和 β 鏈 C 端(氨基酸 200-250),其中 α2 鏈特有的重復序列(如 Pro-Pro-Val-Leu)為 HPT 2-2 型特異性表位;
天然 HPT 的糖基化(N - 糖基化位點位于 α 鏈 Asn38 和 β 鏈 Asn154)可增強抗體識別效率。
 
四、HPT 的電泳特性與生化參數(shù)
SDS-PAGE 分析:
還原條件下:α1 鏈(16 kDa)、α2 鏈(32 kDa)和 β 鏈(27 kDa)分離;
非還原條件下:形成(αβ)₂四聚體(85 kDa)或(α2β)₂多聚體(100 kDa),HPT 2-1 型可見多條分子量介于 85-100 kDa 的條帶(混合多聚體)。
等電聚焦(IEF):
pI 約 4.5-5.5(因糖基化程度而異),酸性蛋白,電泳時向陽極遷移,可與堿性蛋白(如白蛋白 pI 4.7)區(qū)分。
功能活性檢測:
Hb 結(jié)合能力:ELISA 法測定 HPT 與 Hb 的結(jié)合活性,飽和結(jié)合量為 1 mg HPT 結(jié)合 0.8 mg Hb,KD 值≈5×10⁻¹⁰ M;
溶血抑制實驗:體外測定 HPT-Hb 復合物對紅細胞的保護作用,50% 溶血抑制濃度(IC₅₀)約 10-20 μg/mL。
 
五、HPT 的臨床檢測與應用參數(shù)
作為急性時相標志物:
血清正常參考范圍:成人 0.5-2.0 g/L(不同表型略有差異),兒童 0.3-1.5 g/L;
病理升高:感染、創(chuàng)傷、腫瘤時可升高 2-5 倍,半衰期約 3-5 天;
病理降低:溶血性貧血(HPT 與游離 Hb 結(jié)合消耗)、肝。ê铣蓽p少)、先天性 HPT 缺乏癥(罕見,發(fā)病率約 1/10 萬)。
檢測方法學:
免疫比濁法:自動化生化分析儀(如 Roche Cobas c701),檢測范圍 0.1-5.0 g/L,批內(nèi) CV<5%;
ELISA:雙抗體夾心法(包被抗 α 鏈單抗,檢測抗 β 鏈多抗),靈敏度 < 10 mg/L,適用于低濃度樣本(如尿液);
基因型檢測:PCR-RFLP 法區(qū)分 HP1 和 HP2 基因,HPT 2-2 型與糖尿病腎病風險相關。
臨床應用場景:
溶血性疾病鑒別:血清 HPT 降低伴游離 Hb 升高提示血管內(nèi)溶血(如瘧疾、輸血反應);
肝病評估:慢性肝炎或肝硬化時 HPT 合成下降,與肝損傷程度正相關;
炎癥監(jiān)測:動態(tài)監(jiān)測 HPT 水平可評估感染性疾。ㄈ缒摱景Y)的預后。
 
六、HPT 與其他溶血標志物的對比
標志物 檢測樣本 臨床優(yōu)勢 局限性
HPT 血清 / 血漿 特異性結(jié)合 Hb,反映血管內(nèi)溶血 受肝臟合成影響
游離 Hb 血漿 直接反映溶血程度 半衰期短(<1 小時)
乳酸脫氫酶(LDH) 血清 非特異性溶血指標,普及性高 多種組織損傷均可升高
 
七、HPT 的生物學功能延伸
抗氧化與抗炎作用:
HPT-Hb 復合物可清除游離血紅素介導的氧化應激,減少羥基自由基生成;
抑制中性粒細胞活化,下調(diào)炎癥因子(如 TNF-α、IL-6)釋放。
鐵代謝調(diào)控:
結(jié)合 Hb 后被肝巨噬細胞(Kupffer 細胞)通過 CD163 受體內(nèi)吞,促進鐵回收(每分子 HPT-Hb 復合物可回收 4 個 Fe²⁺);
與鐵調(diào)素(Hepcidin)協(xié)同調(diào)節(jié)血清鐵水平,在貧血伴炎癥時發(fā)揮關鍵作用。
 
八、總結(jié)
觸珠蛋白作為急性時相蛋白,其抗原制備以天然提取為主,重組表達需關注 α/β 鏈的正確組裝。電泳特性可用于表型分析,而免疫比濁法是臨床檢測的金標準。HPT 在溶血與炎癥疾病中的雙重角色,使其成為連接血液學與肝病學的重要生物標志物,未來基于 HPT-Hb-CD163 通路的治療策略可能為溶血性疾病提供新方向。
發(fā)布者:費雪(杭州)醫(yī)學研究有限公司
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