II. 概論

• 使用SSsc試劑盒進(jìn)行384次反應(yīng)，精確計算如下試劑體積，為了確保有足夠的試劑進(jìn)行384次四分之一 體積的反應(yīng)，請務(wù)必遵守LV、HV芯片的灌注和預(yù)分配體積。

• LV芯片灌注體積= 5.4 μl
• LV芯片預(yù)分配體積為=1.2 μl
• HV芯片灌注體積=12 μl
• HV芯片預(yù)分配體積=5 μl

• 每一個新的添加物使用一個新的芯片。在一天運(yùn)行結(jié)束后，按照相應(yīng)的洗滌步驟清洗所有LV和HV芯 片。

• 注意避免在整個過程中出現(xiàn)氣泡。 

• 有關(guān)SMART-Seq單細(xì)胞套件的更多信息，請參閱SMART-Seq單細(xì)胞套件用戶手冊。

III. 實驗步驟

A. 用于細(xì)胞分選的384孔板的制備

1. 為了制作CDS分選溶液(CSS)，首先手動注入114μl 10X裂解緩沖液到1.5 ml無核酸酶管中。

2. 添加6μl核糖核酸酶抑制劑(40 U /μl)，通過緩慢混合后快速旋轉(zhuǎn)試劑。

3. 將120μl的3’SMART-Seq CDS Primer II A加入到10X反應(yīng)緩沖液中(總體積為60μl)。

4. 加1,260μl無核酸酶水(總體積1,500μl)。

5. 緩慢旋轉(zhuǎn)混合物。

6. 將750μl的CSS注入兩個1000μl的吸管剪短，并將尖端裝入LVMANTIS芯片(位置1和2)。通過對 MANTIS液體處理器編寫程序，從選擇的位置添加3.2μl CSS到每個孔中。

注:在本實驗方案中，我們假設(shè)FACS對細(xì)胞的分選不會改變板孔中液體的體積。如果分選機(jī)分配了不可忽略體積的鞘液 量，可通過減少無核酸酶水的量來調(diào)整CSS混合物的體積，使其總體積保持在3.2μl /孔。

安全停止點(diǎn)：孔板可在-20°C保存過夜。

B. 細(xì)胞分類

1. 將細(xì)胞直接注入含有CSS的板孔中。

2. 分類完成后，將孔板密封，并將其快速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞到達(dá)孔的底部。

3. 立即將孔板放置于干冰上約5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到-80°C的冰箱。

 

安全停止點(diǎn)：孔板可在-80°C保存過夜。
C. 低聚糖退火
1. 從-80°C的冰箱中取出孔板，讓它解凍約1分鐘，并輕微旋轉(zhuǎn)。然后，向下旋轉(zhuǎn)孔板，收集孔底的 內(nèi)容物。
2. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中，在72°C孵化3分鐘。
3. 孵化3分鐘后，放置到冰塊上2分鐘。
4. 當(dāng)孔板放在冰上時，準(zhǔn)備RT反應(yīng)混合液(D部分)。

D. RT反應(yīng)混合液的制備
1. 將下列試劑按如下順序室溫添加到1.5 ml無核酸酶管中，制備足夠的RT反應(yīng)混合物，進(jìn)行384次 反應(yīng)。務(wù)必在使用前最后添加SMARTScribe™II逆轉(zhuǎn)錄酶，上下輕輕混合。

*該圖表詳細(xì)說明了每種成分進(jìn)行384次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量)，包括以計算移液誤差的補(bǔ)充體積。

2. 在1,000μl的移液管吸頭加入804μl的RT反應(yīng)混合也，裝入LV MANTIS MANTIS液處理器編程，將1.9μl的RT反應(yīng)混合液加入到選擇的孔中。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。

4. 以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。

E. 第一鏈的合成

1. 將孔板從D部分轉(zhuǎn)移到一個預(yù)熱的熱循環(huán)器中，并運(yùn)行以下程序

2. 程序完成后，以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)平板30-60秒。
安全停止點(diǎn)：孔板可在4°C保存過夜。

F. PCR擴(kuò)增cDNA
1. 將以下試劑按照順序加入到2.0 ml冰管中，準(zhǔn)備足夠的384個反應(yīng)的PCR反應(yīng)混合液。請務(wù)必在 使用前最后添加SeqAmp™DNA聚合酶，上下輕輕混合。

 

*該圖表詳細(xì)說明了每種成分進(jìn)行384次反應(yīng)所需的量(相當(dāng)于一孔板的量)，包括以計算移液誤差的補(bǔ)充體積。

2. 在6個1000μl的移液管吸頭加入1030μl PCR主混合液，將每個吸頭裝入HV MANTIS 芯片(位置 1-6)。每1000μl的移液器吸頭，使用MANTIS液體處理器編程，在E階段制備的孔板每孔中加入 15μl的PCR主混合液。

3. 用封口膠帶密封孔板，收集試劑，輕輕旋轉(zhuǎn)3-5次孔板。

4. 以每分鐘2000轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)孔板30-60秒。

5. 將孔板轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的熱循環(huán)器中，運(yùn)行以下程序:

 

*使用以下表格作為指導(dǎo)，以幫助確定輸入的最佳PCR循環(huán)次數(shù):

安全停止點(diǎn)：孔板可在4°C保存過夜。

G. 用NucleoMag NGS純化及片段選擇純化擴(kuò)增的cDNA

cDNA可以通過NucleoMag NGS的純化及片段選擇(Takara Bio, 744970.5, 744970.50，或 744970.500)純化。

注：NucleoMag NGS的純化及片段選擇磁珠懸浮可以用等量的agcourt AMPure XP磁珠代替。

1. 每次使用前，取適量置于室溫下至少30分鐘，攪拌均勻即可。

2. 每次實驗準(zhǔn)備新鮮的80%乙醇。每個樣品需要100μl。

3. 需要一個能容納384孔板的磁力分離架。

4. 將NucleoMag NGS的純化及片段選擇磁珠混合均勻，然后在每個樣品中加16μl。

5. 通過輕輕旋轉(zhuǎn)或上下?lián)u晃移液至少10次，徹底混合。

6. 室溫孵化8分鐘，讓cDNA與磁珠結(jié)合。

7. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約5分鐘或更長時間，直 至液體完全清澈，上清液中無磁珠殘留。

8. 當(dāng)樣品放在磁力分離架上時，用移液管移去上清液并丟棄。

9. 把樣品放在磁力分離架上。每個樣品添加50μl新鮮配制的80%乙醇，不干擾磁珠。等待30秒后， 小心移去含有污染物的上清液。在清洗過程中， cDNA將繼續(xù)結(jié)合在磁珠上。

10. 重復(fù)乙醇清洗(步驟9)一次。

11. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上30秒，然后用吸管除去所 有剩余的乙醇。

12. 在室溫下放置樣品約2-2.5分鐘，直到顆粒不再有光澤，但在裂紋出現(xiàn)之前。

13. 待磁珠干燥后，加17μl的洗脫緩沖液蓋住磁珠。從磁力分離架中取出樣品，徹底混合，重新懸浮磁珠。

14. 室溫孵化2分鐘以補(bǔ)水。

15. 輕輕地旋轉(zhuǎn)樣品，從樣品孔的側(cè)面收集液體。將樣品放在磁力分離架上約1分鐘或更長時間，直 至液體完全清澈。

16. 將含有純化cDNA的上清液從每個孔轉(zhuǎn)移到無核酸酶，低粘附力的管中。在每個試管上貼上樣品 信息標(biāo)簽，并在-20°C保存，直到庫準(zhǔn)備好。

安全停止點(diǎn)：孔板可在-20°C保存過夜。

17. 參考SMART-Seq Single Cell Kit用戶手冊，了解量化和庫準(zhǔn)備選項。