雙特異性抗體（bispecific antibodies, bsAbs）是人工工程化的免疫球蛋白，能夠同時識別同一抗原或不同抗原上的兩個表位。它們的雙重靶向能力使其比傳統單抗更具優勢，在藥物治療中具有顯著前景。

首個雙抗產品于2009年獲批上市——卡妥索單抗（catumaxomab），靶向CD3與EpCAM，用于惡性腹水治療。雖然該藥于2013年退市，但此后雙抗研發迅猛發展。到2023年，全球已有超200種雙抗分子正在進行300多項臨床試驗，其中約75%針對實體瘤，25%針對血液惡性腫瘤。截至2024年底，已有19款雙抗藥物獲批上市。

從結構上看，雙抗可分為不含Fc區（Non IgG-like BsAb）與含Fc區（IgG-like BsAb）。后者又細分為對稱型與非對稱型，其中非對稱型包含四條不同鏈（兩種HC與兩種LC），極易出現鏈錯配，產生大量副產物。即使通過工程手段（如knobs-into-holes、CrossMab）部分緩解錯配，仍難完全消除。對稱型雖副產物較少，但聚集體明顯增多，這可能是因為鏈長增加和柔韌性增強而導致的分子間結構域交換形成的。因此，高效去除錯配產物與聚集體等雜質成為雙抗下游純化的關鍵挑戰。

疏水相互作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）因其在抗體生產中能有效去除聚集體，廣泛應用于下游工藝。

其原理為：根據蛋白表面疏水性差異，利用蛋白和疏水層析介質疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白。

結合-洗脫模式：選擇疏水性合適的的介質，樣品中加入高鹽，蛋白結合，降低鹽濃度洗脫，分離目的蛋白和雜質。

流穿模式：選擇具有高疏水性的介質，不向樣品中加入鹽或者加入低鹽，目的蛋白流穿，雜質結合。

以下為IgG4型雙抗（Fc區引入ScFv）的HIC優化實驗：Load SEC為85.6%，HCP 36 ppm

表1.優化后疏水層析分離效果總結

Fig.1 己二醇和精氨酸洗脫梯度對疏水介質的分離曲線的影響

己二醇、精氨酸能顯著提升純度與回收率。可能的原因在于己二醇、精氨酸可以改善溶液極性，降低疏水相互作用、穩定蛋白構象以及優化洗脫動力學，從而提高了介質選擇性。但在實際應用中需同時考慮添加劑的風險以及去除。從本實驗可知，疏水層析也可通過簡化疏水層析上樣條件，降低工藝復雜性。

疏水介質選擇需綜合考慮配基的疏水性、配基的密度、介質的基質等；可依據如下表所示選擇合適疏水介質

• 配基疏水性強弱：Butyl-S＜Butyl＜Octyl＜Phenyl

Fig.2 疏水層析介質疏水性強弱順序表

• 粒徑影響分辨率：HP系列（34μm）＞Mustang系列（40μm）＞FF系列（90μm）

• 緩沖液種類的選擇：正確選擇鹽的種類和濃度是影響載量和選擇性的重要參數。最常用的鹽溶液是硫酸銨（2M以內，pH不高于8.0）、硫酸鈉、氯化鈉等。不同的鹽對蛋白與疏水介質結合的影響如下順序：

Na₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄ > NaCl > NH₄Cl > NaBr > NaSCN

• 離子強度的選擇：不同的離子強度表現出不同的選擇性，由于離子強度決定樣品的結合力，故隨著鹽濃度的增加，結合力增加，蛋白載量增加，但可能會導致蛋白結合太強或者蛋白沉淀，無法洗脫；而過低的鹽濃度會使蛋白無法結合。對于未知蛋白，初次實驗推薦結合緩沖液：50mM PBS pH7.0，1-1.5M硫酸銨，洗脫緩沖液：50mM PBS pH7.0，可根據該次實驗結果，調整離子強度。

• 添加劑選擇：水溶性醇、去垢劑（改善溶液極性，減少水的表面張力，減弱相互作用導致蛋白解離，如己二醇、異丙醇等）、離序性鹽（降低溶液疏水效果，從而減弱疏水相互作用導致蛋白解離，如CaCl₂、MgCl₂）。

• 溫度控制：因疏水作用為熵驅動，因而隨著溫度的升高，疏水相互作用增加，范德華力增加，從而導致蛋白結合變緊，故實驗需謹慎控制溫度。

疏水層析作為雙抗純化中的關鍵步驟，在去除聚集體等方面展現出獨特優勢。通過選擇合適的介質類型，優化工藝參數，可實現目標分子與雜質的高效分離，實現高純度、高收率目標，助力雙抗純化工藝產業化落地。

[1] Klein, Christian, et al. "The present and future of bispecific antibodies for cancer therapy." Nature reviews Drug discovery 23.4 (2024): 301-319.

[2] Li, Yifeng , et al. "A roadmap for IgG-like bispecific antibody purification." Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics (2020).

[3] Hall, Troii. , G. M. Kelly , and W. R. Emery . "Use of mobile phase additives for the elution of bispecific and monoclonal antibodies from phenyl based hydrophobic interaction chromatography resins." Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences 1096(2018):20-30.

[4] Chen, Serene W , and W. Zhang . "Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies." Antibody Therapeutics 4.2(2021).

[5] Andrews, A. T. . "Protein purification principles, high resolution methods and applications." Food Chemistry (1991).