雙特異性抗體（bispecific antibodies, bsAbs）是人工工程化的免疫球蛋白，能夠同時(shí)識別同一抗原或不同抗原上的兩個(gè)表位。它們的雙重靶向能力使其比傳統(tǒng)單抗更具優(yōu)勢，在藥物治療中具有顯著前景。

首個(gè)雙抗產(chǎn)品于2009年獲批上市——卡妥索單抗（catumaxomab），靶向CD3與EpCAM，用于惡性腹水治療。雖然該藥于2013年退市，但此后雙抗研發(fā)迅猛發(fā)展。到2023年，全球已有超200種雙抗分子正在進(jìn)行300多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中約75%針對實(shí)體瘤，25%針對血液惡性腫瘤。截至2024年底，已有19款雙抗藥物獲批上市。

從結(jié)構(gòu)上看，雙抗可分為不含F(xiàn)c區(qū)（Non IgG-like BsAb）與含F(xiàn)c區(qū)（IgG-like BsAb）。后者又細(xì)分為對稱型與非對稱型，其中非對稱型包含四條不同鏈（兩種HC與兩種LC），極易出現(xiàn)鏈錯(cuò)配，產(chǎn)生大量副產(chǎn)物。即使通過工程手段（如knobs-into-holes、CrossMab）部分緩解錯(cuò)配，仍難完全消除。對稱型雖副產(chǎn)物較少，但聚集體明顯增多，這可能是因?yàn)殒滈L增加和柔韌性增強(qiáng)而導(dǎo)致的分子間結(jié)構(gòu)域交換形成的。因此，高效去除錯(cuò)配產(chǎn)物與聚集體等雜質(zhì)成為雙抗下游純化的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

疏水相互作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）因其在抗體生產(chǎn)中能有效去除聚集體，廣泛應(yīng)用于下游工藝。

其原理為：根據(jù)蛋白表面疏水性差異，利用蛋白和疏水層析介質(zhì)疏水表面可逆的相互作用來分離蛋白。

結(jié)合-洗脫模式：選擇疏水性合適的的介質(zhì)，樣品中加入高鹽，蛋白結(jié)合，降低鹽濃度洗脫，分離目的蛋白和雜質(zhì)。

流穿模式：選擇具有高疏水性的介質(zhì)，不向樣品中加入鹽或者加入低鹽，目的蛋白流穿，雜質(zhì)結(jié)合。

以下為IgG4型雙抗（Fc區(qū)引入ScFv）的HIC優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：Load SEC為85.6%，HCP 36 ppm

表1.優(yōu)化后疏水層析分離效果總結(jié)

Fig.1 己二醇和精氨酸洗脫梯度對疏水介質(zhì)的分離曲線的影響

己二醇、精氨酸能顯著提升純度與回收率�？赡艿脑�因在于己二醇、精氨酸可以改善溶液極性，降低疏水相互作用、穩(wěn)定蛋白構(gòu)象以及優(yōu)化洗脫動(dòng)力學(xué)，從而提高了介質(zhì)選擇性。但在實(shí)際應(yīng)用中需同時(shí)考慮添加劑的風(fēng)險(xiǎn)以及去除。從本實(shí)驗(yàn)可知，疏水層析也可通過簡化疏水層析上樣條件，降低工藝復(fù)雜性。

疏水介質(zhì)選擇需綜合考慮配基的疏水性、配基的密度、介質(zhì)的基質(zhì)等；可依據(jù)如下表所示選擇合適疏水介質(zhì)

• 配基疏水性強(qiáng)弱：Butyl-S＜Butyl＜Octyl＜Phenyl

Fig.2 疏水層析介質(zhì)疏水性強(qiáng)弱順序表

• 粒徑影響分辨率：HP系列（34μm）＞Mustang系列（40μm）＞FF系列（90μm）

• 緩沖液種類的選擇：正確選擇鹽的種類和濃度是影響載量和選擇性的重要參數(shù)。最常用的鹽溶液是硫酸銨（2M以內(nèi)，pH不高于8.0）、硫酸鈉、氯化鈉等。不同的鹽對蛋白與疏水介質(zhì)結(jié)合的影響如下順序：

Na₂SO₄ > (NH₄)₂SO₄ > NaCl > NH₄Cl > NaBr > NaSCN

• 離子強(qiáng)度的選擇：不同的離子強(qiáng)度表現(xiàn)出不同的選擇性，由于離子強(qiáng)度決定樣品的結(jié)合力，故隨著鹽濃度的增加，結(jié)合力增加，蛋白載量增加，但可能會導(dǎo)致蛋白結(jié)合太強(qiáng)或者蛋白沉淀，無法洗脫；而過低的鹽濃度會使蛋白無法結(jié)合。對于未知蛋白，初次實(shí)驗(yàn)推薦結(jié)合緩沖液：50mM PBS pH7.0，1-1.5M硫酸銨，洗脫緩沖液：50mM PBS pH7.0，可根據(jù)該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整離子強(qiáng)度。

• 添加劑選擇：水溶性醇、去垢劑（改善溶液極性，減少水的表面張力，減弱相互作用導(dǎo)致蛋白解離，如己二醇、異丙醇等）、離序性鹽（降低溶液疏水效果，從而減弱疏水相互作用導(dǎo)致蛋白解離，如CaCl₂、MgCl₂）。

• 溫度控制：因疏水作用為熵驅(qū)動(dòng)，因而隨著溫度的升高，疏水相互作用增加，范德華力增加，從而導(dǎo)致蛋白結(jié)合變緊，故實(shí)驗(yàn)需謹(jǐn)慎控制溫度。

疏水層析作為雙抗純化中的關(guān)鍵步驟，在去除聚集體等方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢。通過選擇合適的介質(zhì)類型，優(yōu)化工藝參數(shù)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子與雜質(zhì)的高效分離，實(shí)現(xiàn)高純度、高收率目標(biāo)，助力雙抗純化工藝產(chǎn)業(yè)化落地。

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