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Western Blot中可能遇到的問題的具體解決方案

瀏覽次數:1861 發布日期:2021-6-24  來源:MedChemExpress

 

“我明明按照操作步驟來,為什么就是跑不出?”“為什么我的 WB 總是跑得不干凈?”“日常羨慕文獻里漂亮的 WB 結果”,小小 Western Blot 難倒一片科研黨,又泡了一年實驗室的萌 Cece 已略有經驗~~好東西當然要分享啊~~

 

 

元氣滿滿的一天,相信今天一定會跑出漂亮的條帶。我的小幸福就是看到目的蛋白的那一刻!

 

看我一頓操作猛如虎:
電泳 轉膜 封閉 孵一抗 孵二抗 檢測,剩下的就是等待。

 

圖 1. Western blot 操作流程簡介[1]

 

理想很豐滿,現實很骨感,像在某寶買東西寫差評:跟想象中不一樣。順便再曬幾張“辣眼”買家秀以證現實的殘酷。我的實驗結果中出現了各種稀奇古怪的玩意兒?

 

古怪一:高背景

 

 

 萌 Cece 分析:

1、洗滌不充分,膜沒有洗干凈。

2、封閉不充分,一抗可能直接結合到膜上,造成二抗孵育時在非特異性位點發生結合。

3、一抗/二抗濃度太高,出現非特異性結合。

 

 措施:

1、對于洗滌不充分,可適當增加洗滌次數和時間,也可嘗試提高洗滌液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%)

2、要解決封閉不充分這個問題,可嘗試延長封閉時間,也可更換封閉液。常用的封閉劑有 5% 脫脂奶粉、5% BSA、血清和明膠等,推薦室溫封閉 1 小時以減少背景。另外,脫脂奶粉常含有酪蛋白,由于酪蛋白會結合磷酸化抗體而易產生高背景。因此,檢測磷酸化蛋白時建議用 BSA 作為封閉劑。

3、如果一抗/二抗濃度太高,出現非特異性結合,洗滌也無法完全去除,建議設置多個抗體稀釋梯度,從而篩選出合適的抗體比例。
 

古怪二:斑點

 

 
 萌 Cece 分析: 

封閉液中出現了不溶性物質。

 
 措施: 

建議將封閉液充分溶解后進行過濾。

 

怪三:最頭疼的,沒有按照預期結果出現令人滿意的條帶,如:加入 p38 抑制劑,但 p-p38 表達量沒有變化。

 

 
 萌 Cece 分析:
p38 雖然在不同的細胞中廣泛表達,但是在沒有誘導的情況下,表達量很低。
 

 措施: 

為了成功檢測到 p38 的表達,建議:

1、使用陽性對照確保實驗體系沒有問題。

2、根據實驗設計與需求使用誘導物 (如 LPS) 提高表達量。

 

圖 2. LPS 處理前后 p38 表達量對比[2]

 

SB202190 是一種選擇性的 p38 MAPK 抑制劑。SB202190 與 p38 激酶的 ATP 袋結合。

 

圖 3. 在 LPS 誘導的情況下, SB202190 抑制 p38 磷酸化水平[3]

 

SB203580 是一種 p38 MAPK 的選擇性抑制劑。SB203580 抑制 p38 活性時,只抑制了由誘導劑 (如 LPS) 引起的 p-p38 增加量,但不改變 p-p38 的基礎水平。這是由于 p38 的自身磷酸化,是不受 SB203580 影響的。

 

SB203580 通過降低下游 MAPKAPK2,HSP27 和 ATF2 磷酸化來調節 p38 MAPK 信號通路。SB203580 通過結合 ATP 結合區來抑制 p38 MAPK 的催化活性,但不能抑制上游激酶對 p38 MAPK 的磷酸化。

 

圖 4. SB203580 作用機制[4]

 

So,找到了原因咱再來一次就離成功不遠啦!陽光耀眼,樂觀地,向前走!
 
除了以上建議外,萌 Cece 還有一些超實用法寶:
1、在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制劑 (HY-K0011HY-K0010)。

2、檢測磷酸化蛋白時,加入磷酸酶抑制劑 (HY-K0021HY-K0022HY-K0023)。

3、建議使用 RIPA 裂解液 (強) (HY-K1001)。

4、轉膜結束后,使用麗春紅染色確認轉膜效果。

5、選用高靈敏度的 ECL 發光液, 特超敏 ECL 化學發光試劑盒 (HY-K1005)。

 

參考文獻

 下滑查看更多文獻 

1. Dae-Eun Jeong, et al. Western Blot Analysis of C. elegans Proteins. Methods Mol Biol. 2018; 1742: 213-225.

2. Weiju Wang, et al. Role of TLR4-p38 MAPK-Hsp27 signal pathway in LPS-induced pulmonary epithelial hyperpermeability. BMC Pulm Med. 2018 Nov 27; 18(1): 178. 

3. Yong Li, et al. Mogroside V inhibits LPS-induced COX-2 expression/ROS production and overexpression of HO-1 by blocking phosphorylation of AKT1 in RAW264.7 cells. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2019 Apr 1;51(4):365-374.

4. Gopinathan Pillai Sreekanth, et al. SB203580 Modulates p38 MAPK Signaling and Dengue Virus-Induced Liver Injury by Reducing MAPKAPK2, HSP27, and ATF2 Phosphorylation. PLoS One. 2016 Feb 22; 11(2): e0149486. 

 

發布者:上海皓元生物醫藥科技有限公司
聯系電話:021-58955995
E-mail:sales@medchemexpress.cn

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