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小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

瀏覽次數(shù):5842 發(fā)布日期:2019-8-9  來(lái)源:北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司
原代小知識(shí)——小鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
 
海馬體主要負(fù)責(zé)記憶和學(xué)習(xí),日常生活中的短期記憶都儲(chǔ)存在海馬體中。神經(jīng)元是構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位。神經(jīng)元具有長(zhǎng)突起,由細(xì)胞體和細(xì)胞突起構(gòu)成。
小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的組織來(lái)源于實(shí)驗(yàn)小鼠的正常腦組織,因?yàn)楹qR神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)似于干細(xì)胞屬于高分度分化的細(xì)胞特性,具有不能傳代,不能增殖等特點(diǎn),所有收到細(xì)胞后盡快使用。
 
為了更好的服務(wù)于廣大科研工作者,百歐博偉技術(shù)人員特提供了海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)方法,技術(shù)因人而異僅供參考:
1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑
(1)儀器
生物安全柜
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱
熒光倒置顯微鏡
高速冷凍離心機(jī)
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱
(2)試劑耗材
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶
血球計(jì)數(shù)板
細(xì)胞培養(yǎng)孔板
紅細(xì)胞裂解液
神經(jīng)元完全培養(yǎng)基
0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)
多聚甲醛(PFA)
DAPI
Triton X-100
山羊血清
NSE
Goat anti-Rabbit lgG(H+L)
Cross-Adsorbed Secondary antibody,Alexa Fluor 594
Fluoromount-G熒光封片劑
2.分離培養(yǎng)方法
1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡,
2) 在冰浴的PBS中分離海馬,PBS洗滌3次,剪碎,
3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型膠原酶37℃水浴振蕩消化30min,
4) 用FBS終止消化,輕輕吹打,
5) 過(guò)100 μm 濾網(wǎng),
6) 收集濾液,300 g離心5 min,
7) 用完全培養(yǎng)基重懸沉淀,鋪瓶。
3.免疫熒光
3.1.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)細(xì)胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中,每孔加入培養(yǎng)基1mL,加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔。置培養(yǎng)箱2h或過(guò)夜。
(2)固定
細(xì)胞爬片后,吸出培養(yǎng)基,用PBS洗1遍,加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,放4℃過(guò)夜。
(3)破膜封閉
將玻片除去水分,置于培養(yǎng)皿支撐物上,
玻璃片封閉液配置:0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合,再加10% 血清,
取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h。
(4)一抗孵育
一抗配制:抗體與PBS 1:100(200)稀釋
破膜封閉后,取50uL一抗于防水膜上(濕盒中),將玻片(有細(xì)胞的一面)蓋上置于4℃(最多可放置一周)
(5)二抗孵育
室溫避光孵育二抗(二抗:PBS=1:500)2h后,PBS洗3×5min/次,染DAPI(DAPI:PBS=1:1000)5min,PBS洗3×5min/次。
(6)包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G,將有細(xì)胞的一面蓋上。
鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞
3.2.檢測(cè)結(jié)果
(1)細(xì)胞免疫熒光鑒定照片
陰性
 
100X-DAPI
NSE
 
100X-DAPI
(2)檢驗(yàn)基本情況:
經(jīng)免疫熒光鑒定,該細(xì)胞純度達(dá)到90%以上。
除了上述的細(xì)胞分離方法以外,百歐博偉還有很多關(guān)于其他細(xì)胞的分離方法,想要學(xué)習(xí)的小伙伴可以來(lái)百歐博偉進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)學(xué)習(xí),如果想要其他原代分離培養(yǎng)方法,可打電話或咨詢相關(guān)技術(shù)人員哦。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司自設(shè)細(xì)胞系板塊,是細(xì)胞株提供中心,專(zhuān)業(yè)提供代次低、周期短、活性好的細(xì)胞株。與國(guó)內(nèi)外多家研制單位,生物醫(yī)藥,第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu),科研院所有著良好穩(wěn)定的長(zhǎng)期合作關(guān)系!歡迎廣大客戶來(lái)詢!
 
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