非洲豬瘟P54抗體制備方法及核心參數(shù)
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- 以 ASFV P54 蛋白為抗原：可通過(guò)原核表達(dá)（如大腸桿菌表達(dá)重組 P54 蛋白）或真核表達(dá)（如昆蟲細(xì)胞表達(dá)帶修飾的 P54 蛋白，更接近天然構(gòu)象）獲得高純度抗原，純度需達(dá) 90% 以上，避免雜蛋白干擾免疫效果。
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- 選擇 6-8 周齡 BALB/c 小鼠，采用 “基礎(chǔ)免疫 + 加強(qiáng)免疫” 方案：首次免疫用弗氏完全佐劑乳化抗原（劑量 50-100μg / 只），皮下或腹腔注射；2-3 周后用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫 2-3 次，最后一次免疫后 3-5 天取血清檢測(cè)抗體效價(jià)（效價(jià)≥1:10000 可進(jìn)行下一步）。
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- 取免疫小鼠的脾臟 B 淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）在 PEG（聚乙二醇）作用下融合，形成雜交瘤細(xì)胞；
- 通過(guò) HAT 培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞（排除未融合的 B 細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞），再用間接 ELISA 法篩選能分泌抗 P54 抗體的陽(yáng)性克隆。
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- 對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法或流式細(xì)胞術(shù)克隆化，確保單克隆性；
- 克隆穩(wěn)定后，可通過(guò)小鼠腹腔接種生產(chǎn)腹水型抗體，或通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)液型抗體，經(jīng) Protein G/A 親和層析純化，純度可達(dá) 95% 以上。
二、P54 單克隆抗體的核心參數(shù)及意義
1. 特異性（Specificity）
- 定義：指抗體僅與 ASFV P54 蛋白結(jié)合，而不與其他無(wú)關(guān)蛋白或病原體蛋白交叉反應(yīng)的能力。
- 檢測(cè)方法：
- 采用 Western blot 檢測(cè)抗體與重組 P54 蛋白的結(jié)合（應(yīng)出現(xiàn)單一特異性條帶，分子量約 54 kDa）；
- 檢測(cè)與其他豬病毒（如豬瘟病毒 CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 PRRSV、偽狂犬病病毒 PRV）的結(jié)構(gòu)蛋白是否交叉反應(yīng)；
- 檢測(cè)與健康豬組織蛋白（如肝、脾、腎勻漿）的交叉反應(yīng)。
- 理想標(biāo)準(zhǔn)：僅特異性識(shí)別 ASFV P54 蛋白，與其他病毒及豬自身蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，確保診斷特異性。
- 定義：指抗體與非目標(biāo)抗原（如其他 ASFV 毒株的 P54 蛋白、近緣病毒蛋白）發(fā)生交叉反應(yīng)的概率，通常以百分比表示。
- 檢測(cè)對(duì)象：
- 不同 ASFV 基因型毒株（全球已發(fā)現(xiàn) 24 種基因型）的 P54 蛋白（因 P54 高度保守，交叉率應(yīng)接近 100%，確保對(duì)各毒株均有反應(yīng)）；
- 其他非洲豬瘟相關(guān)病毒（如無(wú)，因 ASFV 為唯一成員）或干擾病毒（如上述 CSFV、PRV 等，交叉率應(yīng)≤1%）。
- 關(guān)鍵意義：對(duì) ASFV 不同毒株的高交叉率可保證檢測(cè)覆蓋范圍，對(duì)其他病毒的低交叉率可避免假陽(yáng)性。
- 定義：指抗體可檢測(cè)到的 P54 蛋白最低濃度（或 ASFV 病毒最低滴度），是衡量檢測(cè)靈敏度的核心指標(biāo)。
- 檢測(cè)方法：
- 用梯度稀釋的重組 P54 蛋白（如 100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL…）通過(guò) ELISA 檢測(cè)，以信號(hào)值為閾值 2.1 倍時(shí)的濃度為 LOD；
- 用梯度稀釋的 ASFV 病毒液（如 10⁶ TCID₅₀/mL、10⁵ TCID₅₀/mL…）通過(guò)免疫熒光或膠體金法檢測(cè)，確定可識(shí)別的最低病毒滴度。
- 典型范圍：優(yōu)質(zhì) P54 單克隆抗體的 ELISA 檢出限通常可達(dá)0.1-1 ng/mL（重組蛋白）或10²-10³ TCID₅₀/mL（病毒液），滿足早期感染檢測(cè)需求。
- 定義：指抗體在低濃度抗原存在時(shí)仍能產(chǎn)生可識(shí)別信號(hào)的能力，與檢出限直接相關(guān)（檢出限越低，靈敏度越高）。
- 實(shí)際應(yīng)用意義：在 ASF 早期感染（病毒載量低）或亞臨床感染階段，高靈敏度抗體可避免漏檢。例如，發(fā)病前 2-3 天的豬血液中病毒含量較低，高靈敏度抗體可通過(guò) ELISA 或膠體金試紙條檢出，為疫情防控爭(zhēng)取時(shí)間。
- 評(píng)價(jià)方式：通過(guò)系列稀釋的陽(yáng)性樣本（病毒液或 P54 蛋白）檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性檢出率（如 LOD 時(shí)的檢出率應(yīng)≥95%）。
- 親和力（Affinity）：指抗體與 P54 抗原的結(jié)合強(qiáng)度，通常以平衡解離常數(shù)（Kd）表示，優(yōu)質(zhì)抗體 Kd 應(yīng)≤10⁻⁸ M（數(shù)值越小，親和力越強(qiáng)），可提高檢測(cè)反應(yīng)速度和穩(wěn)定性。
- 效價(jià)（Titer）：指抗體能與抗原發(fā)生可檢測(cè)反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)（如腹水抗體效價(jià)通常≥1:10⁵，培養(yǎng)液抗體效價(jià)≥1:10⁴），反映抗體濃度和活性。
- 穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性（37℃放置 7 天或 4℃放置 6 個(gè)月，效價(jià)下降≤20%）和批次間一致性（不同批次抗體的檢出限、特異性差異≤10%），確保產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的可靠性。
三、參數(shù)優(yōu)化與應(yīng)用場(chǎng)景
- 膠體金試紙條：需高靈敏度（LOD≤10³ TCID₅₀/mL）、快速反應(yīng)（親和力高），適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩查；
- ELISA 試劑盒：需高特異性（交叉率低）、寬線性范圍（1-1000 ng/mL），適合實(shí)驗(yàn)室定量檢測(cè)；
- 病毒分離鑒定：需對(duì)各基因型毒株高交叉率，確保不遺漏變異毒株。
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