在實(shí)驗(yàn)中大家經(jīng)常遇到這些問(wèn)題：

1.通過(guò)各種在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)獲得miRNA靶向基因，但miRNA對(duì)靶基因的實(shí)際作用不清楚;

2.又或者預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用，而具體活性以及結(jié)合位點(diǎn)仍然需驗(yàn)證;

3.lncRNA或者circRNA吸附miRNA效果如何還未知。

這個(gè)時(shí)候就需要用到熒光素酶(Luciferase)實(shí)驗(yàn)。

熒光素(Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來(lái)自螢火蟲體內(nèi)(Firefly)和海腎(Renilla)體內(nèi)的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。

熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì)發(fā)出生物熒光(bioluminescence)，可通過(guò)熒光測(cè)定儀設(shè)備測(cè)定luciferin氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，常應(yīng)用于啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控及miRNA靶基因驗(yàn)證等方向研究。熒光素酶的具體應(yīng)用，主要有以下兩個(gè)方面：

熒光素酶的應(yīng)用

(一)：pGL3-Basic---用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析。

把待分析啟動(dòng)子區(qū)段構(gòu)建到F-Luciferase上游，和轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染分析F-Luciferase活性即可反應(yīng)啟動(dòng)子的活性高低。該質(zhì)粒通常需要結(jié)合持續(xù)性表達(dá)R-Luciferase的載體作為內(nèi)參以校正不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。

啟動(dòng)子的作用相當(dāng)于“基因開(kāi)關(guān)”，能夠控制基因表達(dá)的起始和表達(dá)。而啟動(dòng)子的活性受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。一些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報(bào)告基因分析(luciferase assay)是檢測(cè)這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合的重要手段。

將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到報(bào)告基因質(zhì)粒中熒光素酶編碼序列的5’端，再與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入特定的熒光素酶底物，通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法則可進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)錄因子與靶標(biāo)啟動(dòng)子的作用

(二)：psiCHECK2---miRNA與其靶點(diǎn)相關(guān)分析,包括miRNA靶基因驗(yàn)證、lncRNA與circRNA吸附miRNA驗(yàn)證等。

需要把miRNA潛在結(jié)合靶點(diǎn)克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區(qū)域，然后與待測(cè)miRNA共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)測(cè)定R-Luciferase活性高低，F(xiàn)-Luciferase (hLuc+)作為校正內(nèi)參校正不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。

miRNA通常功能性作用于靶基因3’UTR，因此可以將目的基因mRNA3’UTR序列插入載體R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區(qū)域， 通過(guò)比較miRNA引起的R-Luciferase活性高低來(lái)定量檢測(cè)miRNA對(duì)目的基因的抑制作用;結(jié)合定點(diǎn)突變等方法則可進(jìn)一步確定miRNA對(duì)靶基因3’UTR的直接靶向序列。

熒光素酶已成為科研中運(yùn)用最廣泛的報(bào)告基因之一，其具有檢測(cè)靈敏度高、結(jié)果重復(fù)性好、信噪比較高和易于檢測(cè)等特點(diǎn)。