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利用脂質體轉染試劑進行293T細胞轉染實驗步驟

瀏覽次數:1455 發布日期:2022-11-9  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
LipoGene2000、Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑是一種常用的陽離子脂質體轉染試劑,它可以 有效地將質粒或 siRNA 以及核酸-蛋白質復合物轉染到培養的貼壁和懸浮細胞系中。研究人員經常使用 LipoGene/ Lipofectamine 系列轉染試劑進行基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除實驗以及基因表達研究。293T細胞轉染實驗步驟如下:



1、細胞培養:以293T細胞轉染前一天(20-24小時)~0.4×10 6 個細胞(具體細胞數取決于細胞大小和細胞生長速度),接種到六孔板中,使其達到70-90%次日轉染時匯合。
2. 在接下來的轉染步驟之前更換新鮮的細胞培養基。培養基的體積約為 2 ml。
3. 輕輕混合 Lip脂質體轉染試劑。
4. 取無菌離心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 4 μg 質粒,用移液器輕輕混勻。
這里需要注意兩點:
a.抗生素、谷氨酰胺等對 LipoGene 轉染或Lipofectamine沒有影響。如果 Lip轉染試劑表現出對靶細胞毒性作用 ,建議從轉染系統中去除抗生素。
b.如果有必要,DMEM 可以更換為其他培養基,如 1640、 MEM、F12 等,這對 Lip轉染試劑 的轉染效率沒有影響。質粒的量可在0.1μg ~4μg范圍內適當調整,Lip的量通常為4~ 8μl(質粒體積/LipoGene體積=1:1~1:2 )。由于細胞類型、培養條件、轉染參數等會極大地影響轉染效率,因此需要在推薦范圍內優化質粒體積/Lip轉染試劑體積。對于其他培養板或培養容器,各試劑用量可參照轉染試劑相關說明表進行換算。
5. 取另一個無菌離心管,在 250 μl DMEM 溶液中加入 6 μl LipoGene,用移液管輕輕混勻,室溫孵育 5 分鐘。
6. 用移液管將步驟 4 中的 DNA 溶液與步驟 5 中的 LipoGene 溶液輕輕混合。這個過程中需要注意不要渦旋或離心。
7. 在室溫下孵育 LipoGene-DNA 混合物 20 分鐘。可能會出現絮狀沉淀,屬于正常現象,不會影響轉染效率。
8. 將 500 μl LipoGene-DNA 混合物加入六孔板的一個孔中,無論是貼壁細胞還是懸浮細胞,然后輕輕搖晃并混合成“8”字形。
9. 注意:對于貼壁細胞,如上所述,只需將 LipoGene-DNA 復合物添加到細胞中并孵育 6 小時,然后再更換溶液。如果轉染懸浮或半懸浮細胞,建議使用平角離心法,在細胞培養皿中加入適量的 LipoGene-DNA復合物后(步驟8),密封密封膜,放入平角離心機,低速 (200 g) 離心 1.5 小時,然后放入培養箱中 6 小時,然后更換培養基。
10. 培養6-12小時后,用完全培養基更換培養基,繼續培養。



這里需要注意的是:當與細胞一起孵育 6 小時時,Lip試劑轉染后的混合物通常足以產生高轉染效率。大多數細胞與 LipGene型轉染試劑一起培養長達 72 小時,沒有明顯的細胞毒性。但是,轉染后6小時更換新鮮培養基可以提高一些生長較快的細胞的轉染效率。對于一些容易轉染的細胞,如HEK-293T細胞,是否更換轉染液主要 取決于細胞的生長狀態,細胞生長快轉染效率就高。

11、細胞轉染后的操作:
1)基因表達,24-40小時后可檢測轉染效率。可以用熒光顯微鏡觀察 GFP 或其他熒光基因的表達。
2)構建穩定細胞株,轉染后24小時可加入合適的篩選藥物如G418或嘌呤霉素篩選穩定細胞株

293t細胞轉染實驗步驟 中的注意事項:
1. 使用高的純度 DNA (A260/A280=1.8) 有助于獲得較高的轉染效率。對于質粒,建議使用 Qiagen 或天根的質粒提取試劑盒進行高質量且無內毒素的提取。
2、細胞的生長狀態會對細胞的轉染效率造成較大影響,所以轉染前細胞要處于良好的生長狀態。
3.轉染試劑盒中一般是不帶DMEM培養基,需要自行配備。其他培養基如 1640、MEM、α-MEM 、F12、DMEM/F12 和 M199 也是可以 可用于轉染實驗的。
4. LipoGene 或Lipofectamine脂質體轉染試劑不能渦旋或離心。當該試劑放置較長時間時,只需輕輕搖晃并混合即可。
5. 試劑長時間暴露在空氣中,也有可能會降低轉染效率。
6、出于健康和安全的考慮,需要在符合潔凈度要求的細胞培養室進行轉染,并穿戴實驗室外套和一次性手套、口罩和無菌帽。

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