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乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測定試劑盒使用說明書

瀏覽次數:1565 發布日期:2022-7-18  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
乙酰膽堿酯酶(AchE)活性測定試劑盒說明書
分光光度法50/48
 
    正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義:
AchE屬于絲氨酸水解酶,廣泛存在于各種動物組織和血清中。AchE催化乙酰膽堿(Ach)水解,在神經傳導調節中起重要作用。
 
測定原理:
AchE催化Ach水解生成膽堿,膽堿與二硫對硝基苯甲酸(DTNB)作用生成5-巰基-硝基苯甲酸(TNB);TNB在412nm處有吸收峰,通過測定412 nm吸光度增加速率,計算AchE活性。
 
自備儀器和用品
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制
提取液:液體×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.6mL試劑一,充分震蕩溶解。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入2.6mL試劑一,充分震蕩溶解。

粗酶液提取:
  • 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進行冰浴勻漿,8000g 4℃離心10min,取上清液待測。
  • 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
  • 血清等液體:直接測定。

測定操作
1. 分光光度計預熱30 min,調節波長到412 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min。
3. 取1mL玻璃比色皿,依次加入100μL上清液、800 μL試劑一、50μL試劑二和50 μL試劑三,迅速混勻,于412nm處測定3min內吸光值變化,第10s吸光值記為A1,第190s吸光值記為A2。△A測定管=A2-A1。
 
AchE活性計算公式:
  • 組織AchE活性
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。
AchE酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(Cpr ×V樣)÷T
 
= 245×△A÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:每克組織每分鐘催化產生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。
AchE酶活(nmol/min/g鮮重)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(W ×V樣÷V樣總)÷T
= 245×△A÷W
  • 細菌、細胞AchE活性
活性單位定義:每104個細胞每分鐘催化產生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。
AchE酶活(nmol/min/104 cell)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 245×△A÷細胞數量
  • 血清AchE活性
活性單位定義:每毫升血清每分鐘催化產生1nmol TNB的酶量為1個酶活單位。
AchE酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V反總×109)÷V樣÷T
=245×△A
ε:TNB摩爾消光系數,13.6×103 L/mol/cm;V反總:反應體系總體積(L),1 mL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:蛋白濃度(mg/mL);W:樣本質量,g;V樣:加入上清液體積(mL),0.1 mL;T:反應時間(min),3 min。
發布者:上海雅吉生物科技有限公司
聯系電話:021-34661276
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