煙草花葉病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒使用方法
瀏覽次數(shù):927 發(fā)布日期:2022-6-29
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一、稀釋標準曲線樣品
(以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
■標記6個離心管,分別為6,5,4,3,2,1。
■用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
■在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■換槍頭,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■換槍頭,在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
■如果有N個樣品,最好設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為NC。
■用自選方法純化樣品的RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒RNAout。
三、Probe qRT-PCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進行)
■如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標記N+9個RT-PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于RT-PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù),則標記N+4個RT-PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于RT-PCR陰性對照(用水做模板),1個用于RT-PCR陽性對照(直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
■在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
成分 |
樣品管
N+2個 |
RT-PCR陰性對照 |
標準曲線樣品管
(1-6管) |
2×Probe qRT-PCR MagicMix |
各10 μL |
10 μL |
各10 μL |
煙草花葉病毒RT-PCR
引物-探針混合液 |
各3 μL |
3 μL |
各3 μL |
N+2個待測RNA樣本 |
各7 μL |
不加 |
不加 |
超純水 |
不加 |
7 μL |
不加 |
第6步所得標準曲線樣品稀釋液(1-6號) |
不加 |
不加 |
各7μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…) |
■蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行RT-PCR:
過程 |
溫度 |
時間 |
逆轉(zhuǎn)錄 |
42℃ |
30 min |
預(yù)變性 |
95℃ |
3 min |
RT-PCR反應(yīng)
(45個循環(huán)) |
95℃ |
15 sec |
60℃ |
1 min(采集FAM通道的熒光信號) |
四、數(shù)據(jù)處理
■如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值,再推算出其濃度。
■如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
五、運輸及保存:低溫運輸,-20℃保存,保存期限為12個月。