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濾紙酶(Filter paper Activity,FPA)試劑盒使用說明書

瀏覽次數:883 發布日期:2022-6-1  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
濾紙酶(Filter paper Activity,FPA)試劑盒說明書
分光光度法50/24
 
    正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義
纖維素酶是由微生物產生的多組分的酶系,能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖,研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測定原理
濾紙酶水解濾紙產生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物,在540nm處有最大光吸收,在一定范圍內反應液顏色深淺與還原糖的量成正比,可測定計算得濾紙酶的活力。

自備實驗用品及儀器
天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制
試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體40mL×1瓶,4℃保存。
濾紙條:50mg×50條。

酶液提取
  • 組織:按照質量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL蒸餾水)加入蒸餾水,冰浴勻漿后于4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測。
  • 細胞:按照細胞數量(104個):蒸餾水體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,12000rpm離心10min,取上清置于冰上待測。
  • 培養液或其它液體:直接檢測。

測定操作
  • 根據樣本數量取兩倍數量的濾紙條和Ep管,每支Ep管中放入一個卷狀濾紙條(注意要放入底部),作為底物。
  • 對照管:取200μL滅活的酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標注為對照管。
  • 測定管:取200μL酶液,加入500μL試劑一,充分混勻,再加入放有濾紙條的Ep管中,標注為測定管。
  • 對照管和測定管同時置于50℃水浴鍋中反應30min。
  • 加入800μL試劑二,沸水浴5min,自來水冷卻后取1mL于1mL玻璃比色皿中測定540nm處吸光值,分別記為A對照管和A測定管。

酶活性計算公式
標準曲線:y = 0.2805x - 0.0255,R2 = 0.9991 
(1)按照蛋白濃度計算
 
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(V樣×Cpr)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷ Cpr
(2)按照樣本質量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/g 鮮重)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷ W
(3)按液體體積計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每毫升培養液每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷V樣÷T= 0.891×(△A+0.0255)
(4)按細胞數量計算
酶活性定義:在50℃,pH4.6條件下,每104個細胞每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V反總÷(V樣×細胞數量(萬個)÷V樣總)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ 細胞數量(萬個)
V反總:反應總體積,1.5mL,V樣:反應體系中加入樣本體積,0.2mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,30min
 
注意事項
  • 用干凈的鑷子取出濾紙條,帶手套卷成卷放入Ep管底部。
  • 樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致,建議沸水浴十分鐘。
  • 批量樣本測定之前先做1-2個樣本的預實驗,若吸光值超過1.2,建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定,計算公式中乘以稀釋倍數。
  • 顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條,以免帶入毛狀物,影響測定結果。
發布者:上海雅吉生物科技有限公司
聯系電話:021-34661276
E-mail:58268971@qq.com

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