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外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纖維二糖苷酶活性測定試劑盒使用說明書

瀏覽次數(shù):1448 發(fā)布日期:2022-5-18  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
外切-β-1,4-葡聚糖酶C1/纖維二糖苷酶活性測定試劑盒說明書
微量法100/48
 
    正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義:
C1(EC3.2.1.91)存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi),是纖維素酶系的組份之一,C1催化多聚糖鏈的末端非還原端釋放出纖維二糖和葡萄糖。
 
測定原理:
采用3,5-二硝基水楊酸法測定C1催化微晶纖維素降解產(chǎn)生的還原糖的含量。
 
需自備的儀器和用品:
酶標(biāo)儀/可見分光光度計(jì)、水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制:
提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體6mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體25mL×1瓶,4℃保存;
 
樣品測定的準(zhǔn)備: 
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
 
測定步驟:
  • 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至540nm,蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在EP管中依次加入下列試劑):
試劑名稱(μL) 測定管 對照管
  樣本 10 10
試劑一 100  
蒸餾水   100
混勻,37℃準(zhǔn)確水浴2h
試劑二 200 200

混勻, 90℃水浴10min(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,測540nm下吸光值A(chǔ),計(jì)算ΔA=A測定管-A對照管。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。
 
C1活性計(jì)算
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 6.4078x - 0.0673;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
2、血清(漿)C1活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷V樣÷T=14.305×(ΔA+0.0673)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中C1活力的計(jì)算
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=14.305×(ΔA+0.0673) ÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷6.4078×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.0286×(ΔA+0.0673)
1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.11mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,120 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
 
b.96孔板測定的計(jì)算公式如下
1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 3.2039x - 0.0673;x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y為吸光值。
2、血清(漿)C1活力的計(jì)算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷V樣÷T=28.61×(ΔA+0.0673)
3、細(xì)胞、細(xì)菌和組織中C1活力的計(jì)算
(1)按照蛋白濃度計(jì)算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(V樣×Cpr) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷Cpr
(2)按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min /g鮮重)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T
=28.61×(ΔA+0.0673) ÷W
 
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義:每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1μg 葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位。
C1活力(μg /min /104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673) ÷3.2039×V反總]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=0.057×(ΔA+0.0673)
1000:1mg/mL=1000ug/mL;V反總:反應(yīng)體系總體積,0.11mL; V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,120 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500萬。
發(fā)布者:上海雅吉生物科技有限公司
聯(lián)系電話:021-34661276
E-mail:58268971@qq.com

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