心血管系統不斷地暴露在由血流和壓力決定的各種機械力之下。有充分證據表明，血壓升高（高血壓）會導致血管重塑。血管壁介質中的血管平滑肌細胞 (VSMCs) 是維持血管穩態所必需的，在體內受到機械循環拉伸。隨著病理性拉伸的增加，VSMCs從收縮型轉變為合成型，其特征是增殖和遷移活動增加，收縮性喪失，細胞外基質產生異常。然而，機械循環拉伸調節 VSMCs 功能的分子機制仍有待進一步闡明。

DKK1 (dickkopf-1) 是 Dickkopf 家族中研究的最深入的分泌蛋白。越來越多的研究表明，DKK1具有腫瘤促進作用。近年來，DKK1也被確立為心血管疾病的新媒介。此外，DKK1 也可作為預測急性缺血性中風和急性冠狀動脈綜合征患者臨床結果的潛在生物標志物。其他一些先前的研究表明， DKK1 在調節人類血管平滑肌細胞的功能中的作用相互矛盾。因此，探索DKK1 在VSMCs 中的作用相關的分子信號通路仍然是一個關鍵的挑戰。

由山東大學齊魯醫院、中國醫學科學院、心血管重塑與功能研究教育部重點實驗室等單位的專家學者先前已經證明，DKK1參與了動脈粥樣硬化的發展。靶向DKK1療法可能不僅有抗腫瘤作用，而且對心血管疾病也有保護作用，一舉兩得。因此，揭示DKK1在心血管疾病發展中的作用，對于指導針對DKK1的抗腫瘤藥物在心血管疾病患者腫瘤中的應用具有重要意義。

該團隊已經證實，DKK1在內皮細胞中的表達在體內擾動流和體外振蕩剪切應力 (OSS) 處理下上調。DKK1 的敲低減弱了OSS 誘導的單核細胞粘附和內皮損傷。目前尚不清楚 DKK1 是否通過機械拉伸調節平滑肌細胞的功能。

因此，該團隊進行了深入研究，于 International Journal of Biological Sciences 上聯合發表了題為《Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application》的研究成果。在這項研究中，以人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)和小鼠為實驗對象，探討了DKK1在病理牽張條件下動脈重塑發展中的作用及其機制。

實驗結果：

機械過度拉伸增加了 VSMCs 中 DKK1 的表達

腹主動脈縮窄 (AAC) 小鼠的收縮壓 (SBP) 和舒張壓 (DBP) 顯著高于假手術對照組小鼠。如圖1 A、C，在手術后1 周，與假手術對照組小鼠相比，AAC 小鼠的胸主動脈和冠狀動脈中膜中檢測到 DKK1 蛋白水平顯著增加。取胸主動脈并通過蛋白質印跡分析，在AAC小鼠中DKK1的相對蛋白表達水平顯著增加（圖1 D)。通過ELISA測定小鼠血清中的DKK1水平，兩組之間未觀察到血清DKK1 水平的差異。

對人 VSMCs 進行了進一步的體外實驗，以驗證 DKK1 響應高水平拉伸的變化。使用循環拉伸加載系統，對 HASMCs 進行不同時間長度（0、3、6、12 或 24 小時）的高強度拉伸（18%），HASMCs 和培養上清液都表現出 DKK1 蛋白水平隨時間依賴性增加 (圖1 E、F)，而當細胞處于5% 循環拉伸時沒有觀察到變化。將HASMCs 在無拉伸、正常拉伸 (5%) 或高強度拉伸 (18%) 的情況下處理 6 小時，然后收集細胞裂解物用于蛋白質印跡分析。DKK1 表達在高水平拉伸處理的細胞中顯著高（P < 0.05，圖1 G）。
 

圖 1

DKK1 有助于在機械拉伸下調節 VSMC 功能

DKK1 在調節 VSMC 功能調控中的作用目前尚不清楚。實驗通過針對DKK1 的小干擾 RNA (siRNA) 轉染到細胞中來降低 VSMCs 中 DKK1 的蛋白質表達。與用干擾siRNA轉染相比，用DKK1-siRNA 轉染 24 小時有效地抑制了 DKK1 mRNA 水平（圖2 A）。

在用 DKK1-siRNA 或干擾 siRNA 轉染后，HASMCs 用 5% 或 18% 的拉伸刺激 24 小時，然后進行 EdU 和 CCK-8 檢測細胞增殖，Transwell 檢測細胞遷移。EdU 和 CCK-8 檢測表明，18% 的循環拉伸顯著促進了 HASMCs 的增殖，而敲低 DKK1 抑制了這種作用（P<0.05，圖2 B-D）。Transwell 測定結果表明，DKK1-siRNA 組中遷移到下腔室的細胞數量顯著低于對照組 (圖2 E、F)。

通過WB法分析全細胞裂解物的增殖標記物PCNA和收縮表型標記物α-SMA的蛋白質水平。與正常拉伸（5%）處理相比，高水平拉伸（18%）上調了PCNA 的蛋白質水平并下調了 α-SMA 的蛋白質水平（圖2 G-I）。通過敲低 DKK1 的表達，這些變化被部分逆轉。外源性rhDKK1的添加促進了細胞增殖和遷移，促進了PCNA的表達并抑制了α-SMA的表達（圖2 J-Q）。
 

圖 2

DKK1 通過靶向 UHRF1 參與調控 HASMC 功能

考慮到 DKK1 被稱為典型 Wnt 信號通路的拮抗劑，研究人員進行了實驗以確定在循環拉伸應用過程中，典型的Wnt通路是否參與了DKK1在HASMC 中的作用。

在差異表達的基因中，重點研究了一個特定的基因，UHRF1。最近的研究結果表明，UHRF1 可能在調節血管平滑肌細胞的增殖、遷移和表型方面發揮重要作用。實驗驗證了在高水平拉伸下UHRF1的蛋白質水平顯著增加，而在正常條件下沒有檢測到變化。當 DKK1 在高水平拉伸下被 siRNA 敲低時，UHRF1 表達在 mRNA 和蛋白質水平上顯著下調（P < 0.05，圖3 C-E)。此外，rhDKK1 的刺激顯著增加了 HASMCs 中 UHRF1 的表達 (圖3 F）。

為了進一步研究 UHRF1 是否介導 DKK1 對 HASMCs 的影響，用 siRNA 敲低 UHRF1 48 小時，并在 rhDKK1 刺激的情況下用正常 (5%) 或高水平拉伸 (18%) 處理細胞 24 小時。然后通過EdU 和 CCK-8 分析評估細胞增殖，Transwell 分析評估細胞遷移， qRT-PCR 評估 RNA 的干擾效率（P < 0.05，圖3 G）。在 rhDKK1 刺激的 HASMCs 中，敲低 UHRF1 顯著減弱了細胞增殖和遷移的增加（P<0.05，圖3 H-L）。同樣，蛋白質印跡分析表明，敲低 UHRF1 后，PCNA 的蛋白水平顯著降低，α-SMA 的蛋白水平升高（P<0.05，圖3 M-O）。
 

圖 3

此外，實驗還證實小鼠平滑肌 (SM) 特異性 DKK1 缺失可改善血管重塑，說明DKK1 參與了由高水平拉伸引起的血管重塑和 VSMC 功能的改變；并且DKK1 是通過 YAP-TEAD 通路調節UHRF1。

實驗結論：

在這里，實驗證明 DKK1 是機械拉伸誘導的 VSMC 表型轉換的關鍵介質。數據表明，高水平的拉伸可在體內和體外誘導 DKK1 的表達。在體內，實驗發現 SMCs 中DKK1 基因的缺失減輕了 AAC 誘導的血管重塑。在體外，機械拉伸誘導的DKK1 通過YAP-TEAD 通路上調 UHRF1，并導致 VSMC 增殖和遷移的增強。

總之，該研究表明，DKK1 通過 YAP-TEAD 通路調節 UHRF1 表達，從而介導平滑肌細胞功能的機械拉伸調控。

參考文獻：Zheng TF, Liu XL, Li X, Wang QQ, Zhao YC, Li X, Li MM, Zhang Y, Zhang M, Zhang WC, Zhang C, Zhang Y, Zhang M. Dickkopf-1 promotes Vascular Smooth Muscle Cell proliferation and migration through upregulating UHRF1 during Cyclic Stretch application. Int J Biol Sci. 2021 Mar 21;17(5):1234-1249. doi: 10.7150/ijbs.56247. PMID: 33867842; PMCID: PMC8040467.

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