非洲豬瘟病毒P54蛋白抗體抗體結(jié)構(gòu)、對(duì)應(yīng)毒株及制備方法
一、非洲豬瘟 P54 蛋白的背景
二、抗 P54 蛋白抗體的結(jié)構(gòu)
1. 單克隆抗體制備
- 基本結(jié)構(gòu)：由兩條重鏈（H 鏈）和兩條輕鏈（L 鏈）通過(guò)二硫鍵連接形成 “Y” 型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)。
- 功能區(qū)域：
- 可變區(qū)（V 區(qū)）：位于 “Y” 型頂端，由重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）組成，負(fù)責(zé)特異性識(shí)別 P54 蛋白的抗原表位（線性或構(gòu)象表位），是抗體靶向結(jié)合的核心區(qū)域。
- 恒定區(qū)（C 區(qū)）：包括重鏈恒定區(qū)（CH1-CH3）和輕鏈恒定區(qū)（CL），決定抗體的類型（如 IgG、IgM 等）和效應(yīng)功能（如激活補(bǔ)體、結(jié)合 Fc 受體等）。
- 常見(jiàn)類型：應(yīng)用中以 IgG 型單克隆抗體為主，因其穩(wěn)定性高、親和力強(qiáng)，適合用于診斷試劑開發(fā)和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。
- 基因 Ⅱ 型：目前在我國(guó)及全球廣泛流行的主流毒株（如 Georgia 2007 株及其變異株）。
- 基因 Ⅰ 型：西非、歐洲部分地區(qū)流行的毒株（如 L60 株、BA71V 株）。
- 其他基因型毒株：如基因 Ⅲ 型至 ⅩⅧ 型（覆蓋非洲、歐洲等地流行株），由于 P54 蛋白序列變異較小，抗體對(duì)多數(shù)毒株均有交叉識(shí)別能力，但具體識(shí)別范圍需通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（如針對(duì)變異位點(diǎn)的抗體可能對(duì)特定毒株識(shí)別能力下降）。
1. 單克隆抗體制備
- 免疫原制備：通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)（如大腸桿菌）或真核表達(dá)系統(tǒng)（如昆蟲細(xì)胞、HEK293 細(xì)胞）重組表達(dá) P54 蛋白（全長(zhǎng)或優(yōu)勢(shì)抗原表位片段），經(jīng)純化后作為免疫原。
- 雜交瘤細(xì)胞構(gòu)建：
- 用重組 P54 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾臟淋巴細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞（如 SP2/0）融合，通過(guò)有限稀釋法篩選能穩(wěn)定分泌抗 P54 抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
- 抗體純化：從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清或小鼠腹水（腹腔接種雜交瘤細(xì)胞獲得）中，采用蛋白 A/G 親和層析、離子交換層析等方法純化，獲得高純度單克隆抗體。
- 以重組 P54 蛋白免疫兔、羊等動(dòng)物，定期采血分離血清，通過(guò)親和層析去除非特異性抗體，獲得多克隆抗體。其優(yōu)勢(shì)是可識(shí)別 P54 蛋白的多個(gè)抗原表位，靈敏度較高，但特異性略低于單克隆抗體。
- 與 ASFV 的特異性結(jié)合：能特異性識(shí)別 ASFV 感染細(xì)胞中的 P54 蛋白或病毒粒子，不與其他豬源病毒（如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病病毒等）發(fā)生交叉反應(yīng)，這是其用于 ASF 特異性診斷的核心基礎(chǔ)。
- 表位特異性：?jiǎn)慰寺】贵w通常針對(duì) P54 蛋白的單一抗原表位（如特定氨基酸序列組成的線性表位，或依賴空間結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位），多克隆抗體則可識(shí)別多個(gè)表位，因此在檢測(cè)中可根據(jù)需求組合使用（如單克隆抗體用于精準(zhǔn)定性，多克隆抗體用于提高檢測(cè)靈敏度）。
- 與其他病毒的交叉反應(yīng)：由于 P54 蛋白是 ASFV 特有的蛋白，且與其他病毒的蛋白序列同源性極低，抗 P54 抗體與其他豬病毒的交叉反應(yīng)率極低（通常 < 1%），確保了診斷的特異性。
- 與不同 ASFV 毒株的交叉反應(yīng)：因 P54 蛋白在 ASFV 各毒株中保守性較高（氨基酸序列同源性通常 > 90%），優(yōu)質(zhì)抗 P54 抗體對(duì)不同基因型毒株的交叉反應(yīng)率較高（一般 > 85%），可覆蓋全球主流流行毒株。但需注意，少數(shù)變異毒株若在 P54 蛋白的抗原表位區(qū)域發(fā)生突變，可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)率下降，因此需結(jié)合當(dāng)?shù)亓餍卸局甑男蛄羞M(jìn)行驗(yàn)證。
- 診斷試劑開發(fā)：用于 ASF 的血清學(xué)檢測(cè)（如 ELISA 檢測(cè)抗體）或病毒抗原檢測(cè)（如免疫熒光試驗(yàn)、膠體金試紙條、免疫組化），是 ASF 快速篩查和確診的重要工具。
- 病毒學(xué)研究：通過(guò)抗體標(biāo)記技術(shù)（如免疫熒光、免疫電鏡）定位 P54 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布，研究其在病毒復(fù)制周期中的功能；或用于病毒中和試驗(yàn)，探索其在抑制病毒感染中的作用。
- 疫苗評(píng)價(jià)：作為免疫應(yīng)答指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)抗 P54 蛋白抗體水平，評(píng)估候選疫苗誘導(dǎo)的體液免疫效果。
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