雙特異性抗體(BsAbs)以其多靶點機制在腫瘤免疫治療中展現巨大潛力。截至2024年底,已有19款BsAb藥物上市,300多項臨床試驗在全球范圍內開展。
由于雙特異性抗體的巨大治療潛力促使迄今為止已開發出超過50種不同的重組雙特異性抗體結構。其可大致分為兩類:不含Fc區的(Non IgG like BsAb)和含Fc區域(IgG like BsAb),含Fc區域又分為對稱性(Symmetric)和非對稱性雙抗(Asymmetric)。
但BsAbs獨特的結構復雜性,也帶來了大量產品相關雜質,如同源二聚體(homodimer)、輕鏈缺失產物(LC-missing byproduct)、半抗(half antibody)以及聚集體等。由于這些雜質與目標分子的物理化學性質接近,常規的離子交換層析往往難以實現有效分離。
為此,復合模式層析(Mixed-Mode Chromatography)作為一種集多種作用力于一體的新型分離純化介質,正在雙抗純化中發揮關鍵作用。
博格隆研發的Diamond MMC Mustang為代表的復合模式介質,具有以下多重機制:
•弱陽離子交換作用
•氫鍵作用
•疏水作用
可廣泛適用于聚集體、片段、輕鏈缺失產物、半抗、同源二聚體等復雜雜質的去除。
•分子:Bispecific antibody
•樣品:Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)
•Buffer:50 mM NaAc-HAc, pH 5.5;50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5
•上樣載量:35 g/L 與 80 g/L
•梯度:0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結果:Diamond MMC Mustang在不同載量下分辨率穩定,媲美進口對標產品
Fig.1 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離純化層析圖譜
Fig.2 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離后樣品的SDS-PAGE結果
去除輕鏈缺失產物•分子:Symmetric WuXiBody
•分離原理:pI差異(雙抗與LC-missing byproduct相差0.21)→結合力不同 → 成功分離
•樣品:Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)
•Buffer:40 mM phosphate buffer, pH 6.0;40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0
•梯度:0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增
結果:實現雙抗與LC-missing byproduct的分離,由SDS-PAGE圖可峰尾為LC-missing byproduct。
Fig.3 復合陽離子介質分離LC-missing byproduct層析圖譜以及質控
線性pH梯度去除半抗與homodimer•分子:Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)
•分離原理:半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集體在復合性陽離子上的結合力差異
•樣品:Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer:20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5;20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0
•梯度:0-100% B 20CV線性pH遞增
結果:由層析圖譜和SDS-PAGE圖可知成功分離半抗、homodimer與聚集體
Fig.4 復合陽離子介質分離半抗、homodimer層析圖譜以及質控
利用疏水作用去除片段與聚集體•分子:Bispecific antibody
•分離原理:高鹽結合,低鹽洗脫 → 去除片段與聚集體
•樣品:Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)
•Buffer:50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0;50 mM Tris-HAc, pH 7.0
•上樣載量:30 g/L
•梯度:0-100% B 20CV 鹽濃度遞減(1M (NH₄)₂SO₄ → 0)
結果:成功分離片段與聚集體,與進口對標產品表現一致
Fig.5 復合陽離子介質分離片段、聚集體層析圖譜以及質控
為了評估填料的批次間的一致性,本實驗使用三個不同批次的Diamond MMC Mustang介質分別裝填的色譜柱,在相同條件下進行了三次純化。
•由疊加層析圖譜,可知三批次洗脫圖譜重現性高,分離效果優異,,三個批次性能高度一致,如下圖所示
•三批次5%DBC也表現出一致性(批次1、2和3的5%DBC分別為94、94和95 mg/ml)
•三批次洗脫液質量、收率表現一致
Fig.6 Diamond MMC Mustang介質三個批次的層析圖譜
復合模式層析作為雙抗下游純化的重要補充手段,憑借其多種作用機制,能有效解決常規層析難以分離的雜質問題。它不僅為產品質量提升提供保障,也為工藝流程簡化提供了新思路。
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參考文獻
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