雙特異性抗體（BsAbs）以其多靶點機制在腫瘤免疫治療中展現巨大潛力。截至2024年底，已有19款BsAb藥物上市，300多項臨床試驗在全球范圍內開展。

由于雙特異性抗體的巨大治療潛力促使迄今為止已開發出超過50種不同的重組雙特異性抗體結構。其可大致分為兩類：不含Fc區的（Non IgG like BsAb）和含Fc區域（IgG like BsAb），含Fc區域又分為對稱性(Symmetric)和非對稱性雙抗（Asymmetric）。

但BsAbs獨特的結構復雜性，也帶來了大量產品相關雜質，如同源二聚體（homodimer）、輕鏈缺失產物（LC-missing byproduct）、半抗（half antibody）以及聚集體等。由于這些雜質與目標分子的物理化學性質接近，常規的離子交換層析往往難以實現有效分離。

為此，復合模式層析（Mixed-Mode Chromatography）作為一種集多種作用力于一體的新型分離純化介質，正在雙抗純化中發揮關鍵作用。

博格隆研發的Diamond MMC Mustang為代表的復合模式介質，具有以下多重機制：

•弱陽離子交換作用

•氫鍵作用

•疏水作用

可廣泛適用于聚集體、片段、輕鏈缺失產物、半抗、同源二聚體等復雜雜質的去除。

去除聚集體與片段

•分子：Bispecific antibody

•樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 5.5)

•Buffer：50 mM NaAc-HAc, pH 5.5；50 mM NaAc-HAc, 1 M NaCl, pH 5.5

•上樣載量：35 g/L 與 80 g/L

•梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增

結果：Diamond MMC Mustang在不同載量下分辨率穩定，媲美進口對標產品

Fig.1 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離純化層析圖譜

Fig.2 Diamond MMC Mustang與某進口介質分離后樣品的SDS-PAGE結果

去除輕鏈缺失產物

•分子：Symmetric WuXiBody

•分離原理：pI差異（雙抗與LC-missing byproduct相差0.21）→結合力不同 → 成功分離

•樣品：Protein A eluate (pH adjusted to 6.0)

•Buffer：40 mM phosphate buffer, pH 6.0；40 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, pH 6.0

•梯度：0-100% B 20CV線性鹽濃度遞增

結果：實現雙抗與LC-missing byproduct的分離，由SDS-PAGE圖可峰尾為LC-missing byproduct。

Fig.3 復合陽離子介質分離LC-missing byproduct層析圖譜以及質控

線性pH梯度去除半抗與homodimer

•分子：Bispecific antibody(Asymmetric IgG-like knobs-into-holes)

•分離原理：半抗、hole-hole homodimer、bsAb、聚集體在復合性陽離子上的結合力差異

•樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)

•Buffer：20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mMTris, 20mM glycine, pH 5.5；20mM Na-citrate, 20mM NaH2PO4, 20mM Tris, 20mM glycine, pH10.0

•梯度：0-100% B 20CV線性pH遞增

結果：由層析圖譜和SDS-PAGE圖可知成功分離半抗、homodimer與聚集體

Fig.4 復合陽離子介質分離半抗、homodimer層析圖譜以及質控

利用疏水作用去除片段與聚集體

•分子：Bispecific antibody

•分離原理：高鹽結合，低鹽洗脫 → 去除片段與聚集體

•樣品：Protein A eluate (pH was adjusted to 7.0 and (NH4)2SO4 was added to 1 M)

•Buffer：50 mM Tris-HAc, 1 M (NH4)2SO4, pH 7.0；50 mM Tris-HAc, pH 7.0

•上樣載量：30 g/L

•梯度：0-100% B 20CV 鹽濃度遞減（1M (NH₄)₂SO₄ → 0）

結果：成功分離片段與聚集體，與進口對標產品表現一致

Fig.5 復合陽離子介質分離片段、聚集體層析圖譜以及質控

為了評估填料的批次間的一致性，本實驗使用三個不同批次的Diamond MMC Mustang介質分別裝填的色譜柱，在相同條件下進行了三次純化。

•由疊加層析圖譜，可知三批次洗脫圖譜重現性高，分離效果優異，,三個批次性能高度一致，如下圖所示

•三批次5%DBC也表現出一致性（批次1、2和3的5%DBC分別為94、94和95 mg/ml）

•三批次洗脫液質量、收率表現一致

Fig.6  Diamond MMC Mustang介質三個批次的層析圖譜

復合模式層析作為雙抗下游純化的重要補充手段，憑借其多種作用機制，能有效解決常規層析難以分離的雜質問題。它不僅為產品質量提升提供保障，也為工藝流程簡化提供了新思路。

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參考文獻

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