腫瘤的生長需要大量能量供給，為滿足其對能量的高需求，腫瘤細胞重編程其新陳代謝，維持他們的生存所需^[1]。營養充足的條件下，細胞喜歡輸入胞內游離氨基酸來滿足其營養需求，但也有許多很存在于細胞外壞境中的氨基酸 (細胞外空間的蛋白質)，在饑餓或營養不良等嚴峻生存條件下，癌細胞以這些細胞外蛋白質為“食”，以便艱苦條件下的茁壯成長。

細胞內營養物質的運輸是一個高度動態和精細調控的過程^[2]，癌細胞究竟是怎樣利用細胞外蛋白質作為營養物質的呢？關鍵的因子和途徑有哪些？
   
當癌細胞處于營養缺乏的環境時，營養物質大多通過一種稱為巨胞飲作用 (macropinocytosis) 的機制來獲取。所謂巨胞飲，指細胞在被營養因子等刺激后，細胞膜皺縮并包裹大量外營養物質，再運送到溶酶體 (細胞中至關重要的的降解區室) 中降解。溶酶體將蛋白質分解成氨基酸, 通過產生細胞內營養源以維持饑餓條件下間細胞功能。
 
 
今年 Science 雜志背靠背發表了關于溶酶體轉運因子 (LYSET) 生物功能的研究性論文的研究性論文^[3,4]，RICHARDS 團隊等人利用 CRISPR 遺傳篩選技術鑒定出一種膜蛋白 LYSET，研究表明 LYSET 對溶酶體酶的運輸至關重要，沒有 LYSET，靶向溶酶體的運輸被嚴重破壞^[3]。

 

 

 
有必要在這里先講一下溶酶體生物發生，它是 M6P 依賴的靶向途徑，需要溶酶體蛋白質的合成和核內體-溶酶體運輸的協調。包括溶酶體酶的合成，高爾基體轉運，以及識別和轉運三部曲 (圖 2)。
 

 

圖 2. 溶酶體水解酶 m6p 依賴靶向途徑^[4]

(1) 溶酶體酶的合成：溶酶體酶在內質網中合成，在那里它們獲得 N-連接的14-糖高甘露聚糖，經過低聚糖連接和修飾，運輸到高爾基體 (cis-Golgi)。 

(2) 高爾基體轉運：N-糖基化溶酶體酶寡糖鏈上的甘露糖殘基被磷酸化，經歷一系列酶促反應，導致甘露糖-6-磷酸 (Mannose-6-phosphate) M6P 基團的加入，會形成 M6P 標志。

(3) 識別和轉運：高爾基體 (trans 面) 某些區域分布著 M6P 受體 (M6P Receptor)，識別 M6P 標志，具有 M6P 修飾的溶酶體酶被 MPR 識別并最后以出芽的方式形成網格蛋白/AP 包被小泡轉運到核內體 (Endosome) 中。

 
 

敲黑板請注意! 高爾基體轉運過程中，M6P 修飾的形成是溶酶體生物發生的重要標志。M6P 基團的加入，第一步由 GlcNac-1-磷酸轉移酶 (GNPT；GlcNAc-1) 完成，第二步由 M6P 揭示酶 (UCE) 完成。GlcNAc-1 的穩定性依賴于 LYSET，沒有 LYSET, GlcNAc-1 跨膜結構域不穩定，M6P 修飾不能形成，酶向溶酶體的運輸道路被嚴重破壞, 溶酶體酶會被錯誤地轉移到細胞表面。

 
以上為溶酶體功能發生的具體過程，那么這一過程究竟是如何被癌細胞利用，作者的研究具體如何進行？下面的故事將圍繞 LYSET 和 GlcNAc-1 展開。
 

■ CRISPR 篩選識別 LYSET

為確定細胞外蛋白質產生營養的細胞途徑 (前面提到有 2 種途徑，胞飲作用和溶酶體分解代謝來攝取營養物質，或直接攝取單體氨基酸)，作者團隊首先選擇了MIA PaCa-2 細胞作為初步篩選模型 (該細胞來源于胰腺癌；是一種營養缺乏的腫瘤類型)，實驗過程中，必需氨基酸亮氨酸 (Leu) 單體形式提供或包含在白蛋白(albumin) ( 3-4 %為生理水平，圖 3a 左), 當 Leu 缺乏，MIA PaCa-2 通過溶酶體白蛋白分解代謝在缺乏 Leu 的培養基中維持增殖 (圖 3b)，即以細胞外蛋白為食, 這個過程中有一個選擇性命中的突出蛋白是跨膜蛋白 LYSET (圖 3c)。

 

為了驗證這種選擇性依賴性，研究者構建了 LYSET-KO MIA PaCa-2 細胞 (圖 3d)。在添加 3% 白蛋白但缺乏亮氨酸的培養基中，LYSET 的缺失強烈抑制了所有癌細胞系的增殖和活力 (圖 3e)。在體實驗中，LYSET 缺陷的癌細胞基本無法在小鼠皮下形成腫瘤 (圖 3f)。 

 

以上結果表明，在營養豐富的條件下，LYSET 對于癌細胞的生長可有可無，但當細胞外蛋白質是必需的營養物質時，體外氨基酸匱乏的條件下，LYSET 是選擇性需要的，為進一步確定其功能，作者團隊探索了 LYSET 在胞飲作用、單體攝入和溶酶體分解代謝中的可能作用。

 

 

圖 3. CRISPR 篩選確定 LYSET 在癌細胞使用細胞外蛋白質作為營養物質時具有選擇性

■ LYSET 是溶酶體降解 Cargos 所必需的必要因子

在 LYSET 缺失的情況下，白蛋白攝取過程和內體貨運輸到溶酶體沒有改變 (圖 4a 和 b；熒光標記 Albumin 檢測白蛋白的攝取和 Dex1/2 追蹤內吞 Cargos 到溶酶體的轉運)，但是由于溶酶體分解代謝顯著降低，熒光標記牛血清白蛋白猝滅 (degradation BSA; DQ BSA) (圖 4c，綠色熒光標記的減少)。

 

圖 4. LYSET 是通過溶酶體分解代謝產生營養物質所必需的

溶酶體分解代謝是兩種代謝途徑的匯合點-胞飲和自噬 (分別可提供胞外和胞內成分)。LYSET 的缺失會導致自噬體蛋白 p62 和 LC3-II 的強烈積累 (圖5a)，溶酶體通過各種酶分解生物分子，而在缺乏 LYSET 的細胞中，許多溶酶體酶的活性降低 (圖5b)。以上結果表明，LYSET 是通過溶酶體分解代謝產生營養物質所必需的，它可能會影響溶酶體酶活性，使溶酶體降解貨物的能力受損。

 

圖 5. LYSET 是大胞細胞和自噬細胞的溶酶體分解代謝所必需的

■ LYSET 缺陷的細胞中，溶酶體酶的最終命運如何？
研究者進一步測定 MIA PaCa-2 細胞的 LYSET KO 蛋白質組的變化 (LFQ)。 LYSET 缺陷細胞 <6% 的蛋白發生了顯著變化，其中自噬貨物受體是最富集的蛋白質之一 (圖 5a), 細胞溶酶體酶和其他溶酶體腔蛋白的整體下降 (圖 5b-c)，但是溶酶體膜蛋白豐度沒有明顯的變化 (圖 5d)。作者團隊還測定了細胞外空間的酶水平。在 LYSET 缺陷細胞的上清液中，組織蛋白酶的未成熟形態顯著增加 (溶酶體管腔蛋白通常富集在細胞上清液中)(圖 5e)。以上結果表明，在沒有 LYSET 的情況下，大多數正常流向溶酶體腔的蛋白質被錯誤地輸送到細胞外空間。 

 

圖 5. LYSET 缺陷的細胞中，溶酶體酶的最終命運

■ LYSET 是甘露糖-6-磷酸途徑的核心成分

前面已經給到大家介紹過：新合成的溶酶體酶在 N-鏈聚糖鏈上接受甘露糖-6-磷酸(M6P) 修飾過程中 (GlcNAc)-1-磷酸轉移酶和 M6P 揭露酶 (UCE) 發揮作用 (圖 6a)。

 

為檢測 M6P 修飾在 LYSET 缺陷細胞中的狀態，使用了一個單鏈抗體片段，專門檢測含有 M6P 的蛋白質，LYSET 缺失會導致含有 M6P-modified 蛋白質的細胞數量大幅下降，這表明 LYSET 是 M6P 通路的一個組成部分。GNPTAB 編碼 GlcNAc - 1-磷酸轉移酶復合物的 a 和 b 亞基)，刪除 LYSET 和 GNPTAB 的任何一個基因，都會引起了 M6P 修飾 (圖 6b) 和成熟的溶酶體酶 (圖 6b-d) 的減少，即使在以細胞外蛋白為營養物質的條件下，細胞增殖都會被抑制 (圖 6e)。 以上表明 LYSET 是 M6P 途徑中溶酶體酶運輸的必要和特定成分。 
 

圖 6. LYSET 是甘露糖-6-磷酸途徑的核心成分

 

總結

營養不良的條件下，細胞從環境中攝取的蛋白質會傳遞給溶酶體，溶酶體將蛋白質分解成組成蛋白質的氨基酸, 產生細胞內營養源，溶酶體可以在饑餓期間維持細胞功能。
 
這一過程通常被實體瘤的癌細胞利用 (如上述胰腺癌)，在這種嚴峻的生存條件下，癌細胞通常使用 LYSET/M6P 依賴的溶酶體蛋白質分解代謝來獲取氨基酸作為營養物質。并且這種途徑是選擇性的，在營養充足的條件下不損害細胞活力和生長。
 
 

參考文獻

1.Vincent El Ghouzzi, Gaelle Boncompain. Golgipathies reveal the critical role of the sorting machinery in brain and skeletal development. Nat Commun. 2022 Dec 1;13(1):7397. 
 
2.Hua Li, Wang-Sik Lee, et al. Structure of the human GlcNAc-1-phosphotransferase αβ subunits reveals regulatory mechanism for lysosomal enzyme glycan phosphorylation. Nat Struct Mol Biol. 2022 Apr;29(4):348-356. 
 
3.Catarina Pechincha, Sven Groessl, Robert Kalis, et al. Lysosomal enzyme trafficking factor LYSET enables nutritional usage of extracellular proteins. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5637. 
 
4. Christopher M Richards , Sabrina Jabs, Wenjie Qiao, et al. The human disease gene LYSET is essential for lysosomal enzyme transport and viral infection. Science.2022 Oct 7;378(6615):eabn5648