iQue高通量流式細胞儀應用：急性髓系白血病新靶點AML新靶點篩選
40年突破！33萬小分子中篩出急性髓系白血病新靶點
AML（急性髓系白血病）是一種讓人談之色變的絕癥，主要的治療方法是化療和造血干細胞移植，四十幾年來新藥寥寥無幾，目前靶向藥只有針對Bcl2的Venetoclax（維奈克拉），所以對于AML開發新的靶向藥顯得尤為重要和迫切。引發AML的原因是由于多個基因的突變，導致髓樣干細胞分化形成一群成熟白細胞的過程受到阻礙，以及未成熟的異常細胞的增殖。
轉錄因子HoxA9在70%的AML病人體內仍然維持活性，而在髓樣干細胞正常的分化過程中該基因必須被關閉。但是到目前為止還未發現針對HoxA9表達調節的抑制劑。美國麻省總醫院和哈佛干細胞研究所的研究人員在含有33萬個化合物的分子庫中篩選這種抑制劑，確定了新的AML的藥物靶點，并發表于Cell雜志上[1]。是的！沒看錯，33萬個化合物！不用高通量手段是萬萬不行的！所以20分鐘即可分析一塊384孔板的高通量流式iQue®大顯身手！
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iQue® 高通量流式細胞儀
研究人員通過基因工程方法建立了能夠持續表達HoxA9的AML小鼠細胞髓樣細胞模型，將GFP（綠色熒光蛋白）和只有在成熟的白細胞中表達的溶菌素融合表達，當細胞達到成熟狀態就會發出綠色熒光。而且為了能讓HoxA9持續高效表達，將HoxA9和ER（雌激素受體）進行融合，可以通過ER的激活劑E2來對HoxA9的表達進行調節。
E2不存在情況下，HoxA9表達被抑制，該細胞系分化成成熟白細胞，產生GFP熒光，并產生CD11b等成熟白細胞表面Marker。
研究人員篩選了超過33萬個小分子（化合物來自于NIH Molecular Library Program’s Molecular Library Small-Molecule Repository (MLSMR)），希望找到能夠讓該細胞系產生綠色信號的小分子，綠色信號的出現意味著HoxA9 表達而導致的分化阻斷得到了疏通。
將每種化合物（4 μM）與細胞（約2500個細胞，共50 μL）混合，加入384孔板中，用ER的拮抗劑fulvestrant作為陽性對照。使用iQue® 對GFP+&CD11b+的藥物進行高通量篩選。
33萬個化合物，一共1000塊384孔板，iQue®可以接機械臂，1個小時可以篩選3塊384孔板，一天24小時輪轉可以測試72塊板，5天不到就可以全搞定啦！
最終篩選到12種化合物，其中有11種通過抑制一種叫做DHODH的代謝酶起到作用，截至這篇文章發表還沒有研究表明DHODH在髓樣干細胞分化過程中發揮作用。進一步實驗表明抑制DHODH的活性確實能夠誘導小鼠和人類AML細胞的分化。
DHODH抑制劑Brequinar結構式
隨后在幾種AML小鼠模型中檢測了一種已知的DHODH抑制劑Brequinar，發現了一套能夠抑制白血病的劑量方案，不但能夠延長生存時間，而且不會出現常規化療導致的副作用。
目前ASLAN公司的ASLAN003是一種口服的高活性DHODH抑制劑，有潛力成為AML治療的全球首創（first-in-class）藥物。該公司已經證明了ASLAN003對 DHODH 的有效抑制，且相比于第一代抑制劑和其他新的 AML 治療不存在相關的毒性，在 AML 患者中都有誘導細胞分化和適用性的潛力。ASLAN003被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration）授予孤兒藥物稱號。目前根據clinicaltrials.gov提供的信息，已經完成了AML適應癥的II期臨床試驗（NCT03451084）[2]。
ASLAN003結構式
可以說沒有iQue®高通量流式細胞儀，這個研究是完不成的。這款流式中的戰斗機為什么牛呢？
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下載白皮書《iQue®高通量流式應對生物制劑發現中的挑戰》，了解更多智能化高通量篩選的妙招！
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-參考文獻-
AML（急性髓系白血病）是一種讓人談之色變的絕癥，主要的治療方法是化療和造血干細胞移植，四十幾年來新藥寥寥無幾，目前靶向藥只有針對Bcl2的Venetoclax（維奈克拉），所以對于AML開發新的靶向藥顯得尤為重要和迫切。引發AML的原因是由于多個基因的突變，導致髓樣干細胞分化形成一群成熟白細胞的過程受到阻礙，以及未成熟的異常細胞的增殖。
轉錄因子HoxA9在70%的AML病人體內仍然維持活性，而在髓樣干細胞正常的分化過程中該基因必須被關閉。但是到目前為止還未發現針對HoxA9表達調節的抑制劑。美國麻省總醫院和哈佛干細胞研究所的研究人員在含有33萬個化合物的分子庫中篩選這種抑制劑，確定了新的AML的藥物靶點，并發表于Cell雜志上[1]。是的！沒看錯，33萬個化合物！不用高通量手段是萬萬不行的！所以20分鐘即可分析一塊384孔板的高通量流式iQue®大顯身手！
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iQue® 高通量流式細胞儀
藥物篩選細胞系（Lys-GFP-ER-HoxA9 cells）的建立
研究人員通過基因工程方法建立了能夠持續表達HoxA9的AML小鼠細胞髓樣細胞模型，將GFP（綠色熒光蛋白）和只有在成熟的白細胞中表達的溶菌素融合表達，當細胞達到成熟狀態就會發出綠色熒光。而且為了能讓HoxA9持續高效表達，將HoxA9和ER（雌激素受體）進行融合，可以通過ER的激活劑E2來對HoxA9的表達進行調節。
E2不存在情況下，HoxA9表達被抑制，該細胞系分化成成熟白細胞，產生GFP熒光，并產生CD11b等成熟白細胞表面Marker。
化合物篩選及功能確認
研究人員篩選了超過33萬個小分子（化合物來自于NIH Molecular Library Program’s Molecular Library Small-Molecule Repository (MLSMR)），希望找到能夠讓該細胞系產生綠色信號的小分子，綠色信號的出現意味著HoxA9 表達而導致的分化阻斷得到了疏通。
將每種化合物（4 μM）與細胞（約2500個細胞，共50 μL）混合，加入384孔板中，用ER的拮抗劑fulvestrant作為陽性對照。使用iQue® 對GFP+&CD11b+的藥物進行高通量篩選。
33萬個化合物，一共1000塊384孔板，iQue®可以接機械臂，1個小時可以篩選3塊384孔板，一天24小時輪轉可以測試72塊板，5天不到就可以全搞定啦！
最終篩選到12種化合物，其中有11種通過抑制一種叫做DHODH的代謝酶起到作用，截至這篇文章發表還沒有研究表明DHODH在髓樣干細胞分化過程中發揮作用。進一步實驗表明抑制DHODH的活性確實能夠誘導小鼠和人類AML細胞的分化。
DHODH抑制劑Brequinar結構式
隨后在幾種AML小鼠模型中檢測了一種已知的DHODH抑制劑Brequinar，發現了一套能夠抑制白血病的劑量方案，不但能夠延長生存時間，而且不會出現常規化療導致的副作用。
新靶點治療AML展望
目前ASLAN公司的ASLAN003是一種口服的高活性DHODH抑制劑，有潛力成為AML治療的全球首創（first-in-class）藥物。該公司已經證明了ASLAN003對 DHODH 的有效抑制，且相比于第一代抑制劑和其他新的 AML 治療不存在相關的毒性，在 AML 患者中都有誘導細胞分化和適用性的潛力。ASLAN003被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration）授予孤兒藥物稱號。目前根據clinicaltrials.gov提供的信息，已經完成了AML適應癥的II期臨床試驗（NCT03451084）[2]。
ASLAN003結構式
可以說沒有iQue®高通量流式細胞儀，這個研究是完不成的。這款流式中的戰斗機為什么牛呢？
- 進樣就像蜻蜓點水，速度快：5分鐘即可完成一塊96孔板檢測，自然就可以實現高通量，最少僅需幾微升樣品；
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-參考文獻-
- Inhibition of Dihydroorotate Dehydrogenase Overcomes Differentiation Blockade in Acute Myeloid Leukemia.Cell
- ASLAN003, a potent dihydroorotate dehydrogenase inhibitor for differentiation of acute myeloid leukemia | Haematologica
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