豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的 N 蛋白（核衣殼蛋白）是病毒的核心結構蛋白，在病毒復制、組裝及免疫應答中發揮關鍵作用。以下從 TGEV N 真核蛋白的基礎特性、真核表達系統、蛋白特性及應用等方面詳細介紹：

一、TGEV N 蛋白的基礎特性

• 基因與結構：由 TGEV 的 ORF7 基因編碼，含 449 個氨基酸殘基（不同毒株可能存在少量差異），屬于磷酸化蛋白，可與病毒基因組 RNA 結合形成核衣殼，包裹病毒 RNA 以維持其穩定性。
• 天然功能：參與病毒 RNA 的復制與包裝，是病毒粒子組裝的核心組件；同時，N 蛋白免疫原性極強，可誘導宿主產生高效價的特異性抗體，是血清學診斷的重要靶標（其抗體出現早、持續時間長，比 S 蛋白更適合早期感染檢測）。
• 分子量：約為47-52 kDa（因磷酸化修飾存在分子量差異）。
• 保守性：在 TGEV 不同毒株中高度保守，且與同屬冠狀病毒（如豬流行性腹瀉病毒 PEDV）的 N 蛋白存在一定交叉反應性，這一特性在診斷中需注意區分。

二、真核表達系統的選擇（為何選擇真核系統）

TGEV N 蛋白存在磷酸化等翻譯后修飾，且其抗原表位（尤其是構象型表位）依賴天然折疊結構，因此真核表達系統是制備具有天然活性 N 蛋白的優選，常用系統包括：

1. 哺乳動物細胞表達系統（如 CHO 細胞、HEK293 細胞）：

   • 優勢：可模擬病毒天然宿主（豬腸道上皮細胞）的翻譯后修飾環境，確保 N 蛋白正確磷酸化和折疊，形成與天然蛋白一致的抗原表位，與抗體的結合特異性高。
   • 局限性：表達量較低（通常為 μg 級 /mL 培養液），培養成本高，周期較長（2-3 周）。
   • 應用：用于制備高靈敏度診斷試劑（如 ELISA 抗體檢測試劑盒）、單克隆抗體制備。

2. 昆蟲細胞表達系統（桿狀病毒介導，如 Sf9、Sf21 細胞）：

   • 優勢：表達量高于哺乳動物細胞（可達 mg 級 /mL），可進行部分真核修飾（如磷酸化），蛋白可溶性好，易于純化。
   • 局限性：磷酸化修飾可能與天然蛋白存在差異，但對 N 蛋白的線性抗原表位影響較小。
   • 應用：適用于大規模制備診斷用抗原（如膠體金試紙條），平衡成本與活性。

3. 酵母表達系統（如畢赤酵母、釀酒酵母）：

   • 優勢：培養成本低，表達量高（可達數百 mg/L），可分泌表達，簡化純化流程。
   • 局限性：翻譯后修飾（如磷酸化）能力較弱，可能導致部分構象型表位缺失，免疫原性略低于哺乳動物細胞表達產物。
   • 應用：用于低成本的血清學篩查試劑，或作為免疫原制備多克隆抗體。

三、真核表達 TGEV N 蛋白的核心優勢

相比原核表達系統（如大腸桿菌），真核表達的 TGEV N 蛋白具有以下關鍵優勢：

• 正確修飾與折疊：N 蛋白的磷酸化是其與 RNA 結合及核衣殼組裝的關鍵，真核系統可模擬這一修飾，確保蛋白功能活性；而原核系統無法實現磷酸化，可能導致抗原表位失真。
• 高免疫原性：真核表達的 N 蛋白保留天然構象，其線性和構象型表位均能有效暴露，誘導的抗體與天然病毒粒子結合能力更強，診斷靈敏度更高。
• 低交叉反應干擾：盡管 N 蛋白在冠狀病毒間存在一定保守性，但真核表達的蛋白因結構更接近天然狀態，可通過優化抗原設計（如選擇特異性表位）降低與其他冠狀病毒的交叉反應。

四、純化與檢測

1. 純化流程：

   • 標簽輔助純化：真核表達的 N 蛋白常融合 His 標簽（6×His）、GST 標簽或 Fc 標簽，通過 Ni²⁺-NTA 親和層析、谷胱甘肽樹脂層析等一步純化，純度可達 85% 以上。
   • 精細純化：結合離子交換層析（如 CM 柱）或凝膠過濾層析，去除宿主蛋白、聚合體等雜質，最終純度可提升至 95% 以上。

2. 活性檢測：

   • 抗原性驗證：通過 Western blot 檢測是否能與 TGEV 陽性血清特異性結合，排除與其他冠狀病毒（如 PEDV）的非特異性反應。
   • 免疫反應性：用 ELISA 檢測其與抗 N 蛋白單克隆抗體的結合效價，評估抗原表位完整性（效價通常需達到 1:10⁴以上）。
   • 功能驗證：通過 RNA 結合實驗（如凝膠遷移實驗）驗證其與病毒 RNA 的結合能力，評估蛋白天然活性。

五、應用領域

• 診斷試劑研發：作為核心抗原用于檢測豬血清中的 TGEV 抗體（如 ELISA、免疫層析試紙條），因其抗體出現早、持續時間長，可用于早期感染篩查和群體免疫水平評估。
• 疫苗佐劑研究：N 蛋白雖非中和性抗原，但可增強機體對病毒的免疫應答，作為亞單位疫苗的輔助成分（與 S 蛋白聯用），提升免疫保護效果。
• 基礎研究：用于探索 TGEV 的復制機制（如與 RNA 結合、核衣殼組裝過程），或作為工具蛋白篩選抗病毒藥物。

總結
TGEV N 真核蛋白因保留天然修飾和構象，是豬傳染性胃腸炎血清學診斷和研究的關鍵材料。其表達系統的選擇需結合應用場景（如診斷靈敏度要求、成本預算），哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達的蛋白因高活性成為主流選擇，廣泛支撐 TGEV 的精準檢測與防控研究。