犬血紅蛋白單克隆抗體的詳細制備流程
一、制備背景與意義
犬血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）是犬紅細胞中負責運輸氧氣的關鍵蛋白，其單克隆抗體在犬類疾病診斷（如貧血、溶血檢測）、血液學研究、藥物研發（如血紅蛋白降解機制研究）等領域具有重要應用價值。制備高特異性的犬血紅蛋白單克隆抗體，需通過雜交瘤技術實現，以下為詳細制備流程。
二、制備關鍵流程
（一）抗原制備與純化
犬血紅蛋白的提取
樣本采集：從健康犬外周血中采集血液（需加入抗凝劑如 EDTA），離心（3000 rpm，10 分鐘）分離紅細胞。
紅細胞裂解：用生理鹽水洗滌紅細胞 3 次，加入低滲裂解液（如 0.3% NaCl）使紅細胞破裂，釋放血紅蛋白。
純化方法：通過層析技術（如離子交換層析、凝膠過濾層析）或電泳法（SDS-PAGE）純化血紅蛋白，去除雜蛋白，并用紫外分光光度計測定濃度（純度需≥95%）。
抗原佐劑混合
將純化的犬血紅蛋白與佐劑（如弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑）按 1:1 體積比混合，充分乳化，增強抗原免疫原性。
（二）動物免疫
實驗動物選擇
選用 6-8 周齡 SPF 級 Balb/c 小鼠（免疫原性好、雜交瘤融合效率高），每組 3-5 只。
免疫方案
初次免疫：小鼠背部多點皮下注射乳化抗原（50-100 μg / 只），使用弗氏完全佐劑。
加強免疫：每隔 2-3 周注射一次，共 3-4 次，改用弗氏不完全佐劑，劑量同初次。
免疫效果檢測：末次免疫后 7-10 天，采集小鼠尾尖血，用 ELISA 法檢測血清抗體效價，選擇效價≥1:10000 的小鼠進行后續實驗。
（三）脾細胞獲取與細胞融合
脾細胞制備
對抗體效價高的小鼠，末次免疫后 3 天，頸椎脫臼處死，無菌取出脾臟，研磨過篩，制備單細胞懸液，用 PBS 洗滌 2 次，計數細胞。
骨髓瘤細胞準備
選用對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞（如 SP2/0 或 NS0 細胞），用完全培養基（含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640）培養，離心收集細胞，與脾細胞按 1:3-1:5 比例混合。
細胞融合
在 50% 聚乙二醇（PEG 1500-2000）作用下，37℃孵育 1-2 分鐘誘導融合，隨后加入預熱的不完全培養基終止反應，離心收集細胞，用 HAT 選擇性培養基重懸，接種于 96 孔細胞培養板（每孔約 2×10^5 個細胞）。
（四）雜交瘤細胞篩選與克隆化
HAT 培養基篩選
培養 4-5 天后，未融合的脾細胞（不能長期存活）和骨髓瘤細胞（缺乏 HGPRT 或 TK 酶，無法在 HAT 培養基中增殖）死亡，僅雜交瘤細胞存活。
ELISA 法篩選陽性克隆
培養 7-10 天后，取培養上清，以純化的犬血紅蛋白為包被抗原，用 ELISA 法篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞孔（OD 值≥陰性對照 2.1 倍為陽性）。
有限稀釋法克隆化
將陽性孔細胞用有限稀釋法（調整細胞濃度至 0.5-1 個細胞 / 孔）接種于 96 孔板，培養后再次用 ELISA 篩選單克隆細胞，重復 3 次，確保單克隆細胞株的穩定性。
（五）單克隆抗體的生產與純化
體內誘生法
向 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（1 周前）預處理，隨后接種雜交瘤細胞（1×10^6 個 / 只），7-10 天后收集腹水，腹水抗體濃度高（可達 1-10 mg/mL），適用于大量制備。
體外培養法
將雜交瘤細胞接種于血清 - free 培養基或懸浮培養體系，收集培養上清，抗體濃度較低（約 50-200 μg/mL），但純度較高，適用于小規模制備。
抗體純化
腹水純化：先用硫酸銨沉淀法去除雜蛋白，再通過 Protein A/G 親和層析、離子交換層析進一步純化，獲得高純度單克隆抗體。
上清純化：直接通過親和層析或超濾法濃縮純化。
（六）抗體鑒定
效價測定
ELISA 法檢測抗體滴度，腹水抗體效價應≥1:10^5，上清效價≥1:10^3。
特異性鑒定
Western blot：檢測抗體與犬血紅蛋白的特異性結合，同時驗證是否與其他犬類蛋白（如血清白蛋白、其他紅細胞抗原）交叉反應。
免疫熒光或免疫組化：驗證抗體對犬紅細胞中血紅蛋白的定位特異性。
亞型鑒定
用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒，確定抗體的 Ig 亞型（如 IgG1、IgG2a 等），便于后續應用選擇。
三、關鍵注意事項
抗原純度：雜質會導致非特異性抗體產生，純化后的抗原需通過 SDS-PAGE 和 Western blot 驗證。
免疫周期：過度免疫可能導致小鼠免疫耐受，免疫間隔和次數需嚴格控制。
細胞融合效率：PEG 作用時間和溫度需精確控制（37℃，1-2 分鐘），避免細胞損傷。
無菌操作：雜交瘤培養過程中需嚴格無菌，避免細菌或支原體污染。
動物倫理：實驗需符合動物保護倫理規范，使用 SPF 級動物并減少痛苦。
四、應用方向
診斷試劑開發：用于犬貧血、溶血性疾�。ㄈ缑庖呓閷匀苎载氀┑目焖贆z測試劑盒。
基礎研究：研究犬血紅蛋白結構與功能、紅細胞生成機制或寄生蟲（如巴貝斯蟲）與血紅蛋白的相互作用。
治療研究：作為靶向載體，結合藥物用于犬血液系統疾病的靶向治療（如實驗性研究）。
犬血紅蛋白（Hemoglobin, Hb）是犬紅細胞中負責運輸氧氣的關鍵蛋白，其單克隆抗體在犬類疾病診斷（如貧血、溶血檢測）、血液學研究、藥物研發（如血紅蛋白降解機制研究）等領域具有重要應用價值。制備高特異性的犬血紅蛋白單克隆抗體，需通過雜交瘤技術實現，以下為詳細制備流程。
二、制備關鍵流程
（一）抗原制備與純化
犬血紅蛋白的提取
樣本采集：從健康犬外周血中采集血液（需加入抗凝劑如 EDTA），離心（3000 rpm，10 分鐘）分離紅細胞。
紅細胞裂解：用生理鹽水洗滌紅細胞 3 次，加入低滲裂解液（如 0.3% NaCl）使紅細胞破裂，釋放血紅蛋白。
純化方法：通過層析技術（如離子交換層析、凝膠過濾層析）或電泳法（SDS-PAGE）純化血紅蛋白，去除雜蛋白，并用紫外分光光度計測定濃度（純度需≥95%）。
抗原佐劑混合
將純化的犬血紅蛋白與佐劑（如弗氏完全佐劑 / 不完全佐劑）按 1:1 體積比混合，充分乳化，增強抗原免疫原性。
（二）動物免疫
實驗動物選擇
選用 6-8 周齡 SPF 級 Balb/c 小鼠（免疫原性好、雜交瘤融合效率高），每組 3-5 只。
免疫方案
初次免疫：小鼠背部多點皮下注射乳化抗原（50-100 μg / 只），使用弗氏完全佐劑。
加強免疫：每隔 2-3 周注射一次，共 3-4 次，改用弗氏不完全佐劑，劑量同初次。
免疫效果檢測：末次免疫后 7-10 天，采集小鼠尾尖血，用 ELISA 法檢測血清抗體效價，選擇效價≥1:10000 的小鼠進行后續實驗。
（三）脾細胞獲取與細胞融合
脾細胞制備
對抗體效價高的小鼠，末次免疫后 3 天，頸椎脫臼處死，無菌取出脾臟，研磨過篩，制備單細胞懸液，用 PBS 洗滌 2 次，計數細胞。
骨髓瘤細胞準備
選用對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞（如 SP2/0 或 NS0 細胞），用完全培養基（含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640）培養，離心收集細胞，與脾細胞按 1:3-1:5 比例混合。
細胞融合
在 50% 聚乙二醇（PEG 1500-2000）作用下，37℃孵育 1-2 分鐘誘導融合，隨后加入預熱的不完全培養基終止反應，離心收集細胞，用 HAT 選擇性培養基重懸，接種于 96 孔細胞培養板（每孔約 2×10^5 個細胞）。
（四）雜交瘤細胞篩選與克隆化
HAT 培養基篩選
培養 4-5 天后，未融合的脾細胞（不能長期存活）和骨髓瘤細胞（缺乏 HGPRT 或 TK 酶，無法在 HAT 培養基中增殖）死亡，僅雜交瘤細胞存活。
ELISA 法篩選陽性克隆
培養 7-10 天后，取培養上清，以純化的犬血紅蛋白為包被抗原，用 ELISA 法篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞孔（OD 值≥陰性對照 2.1 倍為陽性）。
有限稀釋法克隆化
將陽性孔細胞用有限稀釋法（調整細胞濃度至 0.5-1 個細胞 / 孔）接種于 96 孔板，培養后再次用 ELISA 篩選單克隆細胞，重復 3 次，確保單克隆細胞株的穩定性。
（五）單克隆抗體的生產與純化
體內誘生法
向 Balb/c 小鼠腹腔注射石蠟油（1 周前）預處理，隨后接種雜交瘤細胞（1×10^6 個 / 只），7-10 天后收集腹水，腹水抗體濃度高（可達 1-10 mg/mL），適用于大量制備。
體外培養法
將雜交瘤細胞接種于血清 - free 培養基或懸浮培養體系，收集培養上清，抗體濃度較低（約 50-200 μg/mL），但純度較高，適用于小規模制備。
抗體純化
腹水純化：先用硫酸銨沉淀法去除雜蛋白，再通過 Protein A/G 親和層析、離子交換層析進一步純化，獲得高純度單克隆抗體。
上清純化：直接通過親和層析或超濾法濃縮純化。
（六）抗體鑒定
效價測定
ELISA 法檢測抗體滴度，腹水抗體效價應≥1:10^5，上清效價≥1:10^3。
特異性鑒定
Western blot：檢測抗體與犬血紅蛋白的特異性結合，同時驗證是否與其他犬類蛋白（如血清白蛋白、其他紅細胞抗原）交叉反應。
免疫熒光或免疫組化：驗證抗體對犬紅細胞中血紅蛋白的定位特異性。
亞型鑒定
用小鼠單克隆抗體亞型檢測試劑盒，確定抗體的 Ig 亞型（如 IgG1、IgG2a 等），便于后續應用選擇。
三、關鍵注意事項
抗原純度：雜質會導致非特異性抗體產生，純化后的抗原需通過 SDS-PAGE 和 Western blot 驗證。
免疫周期：過度免疫可能導致小鼠免疫耐受，免疫間隔和次數需嚴格控制。
細胞融合效率：PEG 作用時間和溫度需精確控制（37℃，1-2 分鐘），避免細胞損傷。
無菌操作：雜交瘤培養過程中需嚴格無菌，避免細菌或支原體污染。
動物倫理：實驗需符合動物保護倫理規范，使用 SPF 級動物并減少痛苦。
四、應用方向
診斷試劑開發：用于犬貧血、溶血性疾�。ㄈ缑庖呓閷匀苎载氀┑目焖贆z測試劑盒。
基礎研究：研究犬血紅蛋白結構與功能、紅細胞生成機制或寄生蟲（如巴貝斯蟲）與血紅蛋白的相互作用。
治療研究：作為靶向載體，結合藥物用于犬血液系統疾病的靶向治療（如實驗性研究）。
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