常見實驗技術免疫染色 (IHCICCIF) 全流程解析
IHC/ICC/IF 總迷糊? 免疫染色為啥感覺那么多？
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Section.01
免疫染色知多少?
免疫染色 (Immunostaining) 是一項重要的生物學技術，主要用于檢測組織切片中的特定抗原并獲取有關細胞結構的信息。
免疫染色是基于抗體與其靶抗原的特異性結合 (圖 1)�？乖贵w復合物的檢測依賴于與抗體偶聯的標記物。使用酶時，需要酶的比色法或化學發光法底物。酶催化反應生成有色產物，可使用光學顯微鏡檢測。對于熒光染料，可使用熒光顯微鏡測量熒光信號，無需額外的底物[1]。
圖 1. 免疫染色的典型工作流程。免疫染色始于細胞或組織制備，其中特定細胞或組織樣本被固定以保留其結構。然后將樣本與封閉緩沖液孵育，以防止抗原和抗體之間的非特異性結合。隨后，將樣本與特異性結合目標抗原的一抗孵育，再與連接熒光染料或酶的二抗孵育。清洗去除多余抗體后，使用封固劑將樣本封固在載玻片上。最后，使用合適的顯微鏡觀察抗原-抗體復合物。
免疫染色：直接法 or 間接法?
免疫染色主要使用兩種方法：間接免疫染色法和直接免疫染色法。
- 間接法：同時使用一抗和二抗。一抗可特異性結合目標抗原。一抗通常在動物體內通過注射特定抗原而產生 (例如山羊、小鼠或兔子)。二抗通常與可檢測標記物（例如酶或熒光染料）偶聯，并與一抗結合。為防止交叉反應，最好使用與產生一抗的物種不同的二抗。多個二抗可以與每個一抗相互作用，從而增強可檢測信號。此外，一種二抗可以與多種一抗一起使用。
- 直接法：使用與特異性結合抗原的可檢測標記物偶聯的單一抗體。該方法只需一步抗體孵育，比間接法更簡單、更快捷。然而，由于直接法使用單一抗體，其靈敏度低于間接法，而且由于可用的探針/酶偶聯一抗有限，其應用受到限制。
圖 2. 直接法和間接法示意圖。
兩種方法各有優勢，研究人員可參考下面表格 (表 1)[1]，根據實驗目的選擇合適的方法！
表 1. 直接和間接免疫染色方法的特點
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免疫染色：ICC、IHC 與 IF?
ICC 與 IHC 均屬于免疫染色。免疫組化 (Immunohistochemistry, IHC) 是用于檢測組織切片中特定抗原或蛋白質，廣泛應用于病理學，以診斷癌癥等疾病和研究組織特異性蛋白質測定。當應用于細胞學制備時，通常稱為免疫細胞化學 (Immunocytochemistry, ICC)，其適用于多種細胞學樣本，例如細胞塊、風干玻片、乙醇固定玻片、直接涂片、細胞離心涂片和液基細胞學 (Liquid-based cytology, LBC) 樣本[2][3]。ICC 常用于識別細胞中特定生物標志物的存在、亞細胞定位和原位大分子相互作用[1]。
免疫熒光 (Immunofluorescence, IF) 也是利用抗體和抗原的結合特異性，是免疫染色的一種廣泛應用的例子。IHC 通常使用多種不同的酶標記物來檢測目標抗原。(當然，IHC 也可升級為多重熒光染色的 mIHC)。ICC 通過使用與抗體偶聯的熒光染料或酶，可以分別在熒光顯微鏡和光學顯微鏡下可視化目標抗原。IF 利用熒光顯微鏡檢測與抗體結合的熒光染料，此外，IF 可進行多種熒光染色，允許研究人員進行多重標記，IF 的多重染色常用于評估大分子的共定位[1]。
注意：對于多重染色，需要選擇發射光譜不重疊的熒光染料，以防止光譜重疊導致信號錯誤解讀。
表 2. 不同類型免疫染色的特點[1]
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Section.02
ICC/IF: 實操流程
往期我們為大家介紹了免疫組化，本期我們來了解下 ICC/IF 究竟如何做？
第一步：樣品準備
細胞免疫熒光技術是一種基于抗體與標記物相互作用的技術。它通過特異性的抗體與細胞表面或細胞內分子結合，再通過標記物在熒光顯微鏡下進行觀察。實驗流程通常包括樣品制備、固定、通透、封閉、抗體孵育、復染、封片和觀察 8 個部分。
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圖 3. ICC/IF 實驗流程圖。目的
根據實驗設計，準備狀態良好的細胞樣品。細胞培養是實驗的基礎，細胞狀態直接影響實驗結果。
步驟
基本步驟：
1. 準備蓋玻片或共聚焦小皿。蓋玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，蓋玻片完全干燥后移至細胞培養板中，整個過程注意無菌操作。
2. 鋪細胞。在包被的蓋玻片或板上鋪適當的細胞，使后續固定細胞時，融匯度達到 50-60%。如果細胞過密或過稀，正常細胞結構可能會受到影響。
3. 收集樣品。針對貼壁細胞，細胞繼續培養 12 h，細胞牢牢貼壁后，收集樣品進行后續操作。而對于懸浮細胞，可以通過甩片進行。
Tips:
① 盡量選用新鮮制備的樣本，并確定樣品中抗原分子的表達豐度；
② 后續所有操作，動作要輕柔，避免細胞脫落；
③ 后續所有操作都需避免干片。
第二步：固定
目的
使用固定劑（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）處理細胞，使蛋白質變性凝固，從而固定細胞形態和結構。同時，固定劑還能減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，保護抗原性。
固定劑如何選？
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步驟
1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定細胞 10 ~ 15 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留的固定液。
Tips:
① 初次實驗，建議從 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 開始嘗試，倘若沒有達到預期效果，再調整固定時間或更換另一種固定劑。
② 較長的孵育時間通常會導致更高的固定程度，直至表位可能過度固定。孵育時間短可能導致表位保存不良和樣品固定不足。最佳固定時間需要根據經驗確定。
第三步：通透
目的
通過去污劑部分溶解細胞膜，形成孔洞，從而使抗體能夠到達細胞內表位，與細胞內的抗原結合。（該步驟可選做；通透步驟會破壞細胞膜，細胞膜表面抗原不適合選擇通透實驗）
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圖 4. 細胞膜打孔處理示意圖。通透劑如何選？
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步驟
1. 通透：加入 0.1–0.25% Triton X-100 (PBS 配制)，覆蓋細胞，室溫下通透 5-10 min；
2. 洗滌：使用 PBS 緩沖液清洗 3 次，以去除殘留通透液。
Tips:
① 通透劑的濃度和孵育時間應針對所用樣品進行優化。
第四步：封閉
封閉液中的成分能夠與細胞表面的非特異性位點結合，從而阻止抗體與這些位點的非特異性結合。
目的
根據實驗設計，準備狀態良好的細胞樣品。細胞培養是實驗的基礎，細胞狀態直接影響實驗結果。
封閉液的選擇
可以選擇與二抗相同來源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗為山羊抗小鼠，應選擇山羊血清作為封閉劑。
步驟
使用 2-10% 的 BSA/山羊血清，室溫或 37℃ 封閉 1 h。
Tips:
① 封閉溶液不應含有一抗的宿主動物血清，因為這可能會導致高背景。
第五步：抗體孵育
目的
使抗體充分與目的蛋白抗原結合，決定了熒光信號的位置和特異性，進而影響實驗結果的準確性和可靠性。
注意：該步驟可選擇 (i) 直接檢測，一抗直接與熒光基團偶聯。(ii) 間接檢測，使用合適的熒光標記二抗檢測一抗。這兩種方法各有優點和缺點，其中，間接檢測是最常用的檢測方法。
抗體的選擇
- 單染：一抗要選擇任一宿主來源的抗體，二抗選擇對應的抗一抗宿主的抗體。例如，一抗是小鼠來源，二抗要選擇抗小鼠的抗體 (如山羊抗小鼠，驢抗小鼠等)。
- 雙染/多染：在進行多個熒光標記實驗時，一抗要選擇不同宿主來源的抗體，二抗選擇對應的抗一抗宿主的抗體。同時要注意選擇具有高區分度的熒光二抗，避免熒光重疊。例如，在進行三色熒光標記時，一般選用綠色、藍色和紅色這三種熒光基團，以確保每個信號都能被清晰地區分出來。
步驟
基本步驟：
(以間接檢測為例)：
1. 一抗孵育：根據研目標抗原和樣品特性選擇符合要求的一抗，并按照說明書要求稀釋一抗，加入到樣品中并在 4℃ 條件下孵育過夜 (12 ~ 16 h)。
2. 洗滌：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未結合的抗體。洗滌次數和時間可根據實驗條件調整。
3. 二抗孵育：根據一抗的種類及樣品特性 (二抗攜帶的熒光需要與樣品自帶熒光不沖突) 選擇合適的熒光標記的二抗，在室溫下避光孵育 1 h。稀釋和使用方法應遵循說明書。
4. 洗滌：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 搖床緩慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未結合的抗體。洗滌次數和時間可根據實驗條件調整。
Tips:
① 孵育熒光二抗之后，一定要注意避光保存！
② 確定合適的二抗工作濃度濃度，避免無信號或背景過高現象的發生；
③ 注意濕盒的保濕效果，避免樣品的干燥；
④ 洗滌時轉速要溫和，防止細胞脫片。
第六步：復染
目的
使用染色劑對細胞核進行染色，直觀地區分細胞核和其他細胞及抗原結構的位置，便于觀察和解讀實驗結果。
步驟
在清洗完畢的細胞中滴加 DAPI，室溫避光靜置約 30 s。
第七步：封片
目的
保護已經染色的樣本，防止其受到外界環境的損害。同時，封片還有助于保存實驗結果，便于后續的分析和比較。
步驟
1. 封片：向載玻片上加入一滴封片劑，將蓋玻片緩慢扣在載玻片上，細胞所在面靠近載玻片，用吸水紙吸除多余封片劑。
2. 觀察：輕輕用指甲油密封蓋玻片四周，避免樣品在顯微鏡下移動。指甲油干透后，直接觀察或 4℃ 下避光保存。
Tips:
① 避免氣泡：在封片過程中，需要避免產生氣泡。氣泡會干擾顯微鏡下的觀察，影響實驗結果的準確性。因此，在滴加封片液時，需要緩慢而均勻地滴加，并用鑷子輕輕調整蓋玻片的位置，以確保沒有氣泡產生。
② 選擇合適的封片劑：封片劑的選擇也很重要。常用的封片劑包括緩沖甘油、抗熒光淬滅封片液等。在選擇封片劑時，需要根據實驗的具體需求和標本的特性進行選擇。
③ 保持避光和濕度：封片后，需要將標本放置在避光和濕度適宜的環境中保存。這可以有效地防止熒光信號的淬滅和標本的干燥，確保實驗結果的穩定性和準確性。
④ 細胞樣品在封片劑處理后，理論上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，為了成像清晰和高熒光強度，建議盡快進行成像分析。
第八步：觀察
成像及分析：在顯微鏡下觀察并采集圖像，并對結果進行實驗分析。
讓我們再來看看科研人的期刊文獻中的免疫熒光 (IF) 成果圖吧！
圖 5. 亞細胞結構免疫熒光圖[1]。
當然，如果你沒有使用與抗體偶聯的熒光染料，那么你的圖片是這樣的！
圖 6. 腫瘤標志物 P63 的 ICC 檢測。在 LBC 玻片上進行 p63 染色�？梢姾巳旧�，突出肌上皮細胞�？梢钥吹� (a) 中一片較大的細胞，(b) 中一小簇細胞。兩者均顯示中度細胞異形性，且染色細胞數不足 25%。如果這是標本的主要形態，則足以支持惡性腫瘤的診斷。
好啦，朋友們，到這里細胞免疫熒光實驗就結束啦！怎么樣？有沒有躍躍欲試的小念頭？如有購買需求或實驗疑惑都可 Call 小 M 喔~
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[1] Park G, et al. Brief guide to immunostaining. Mol Cells. 2025 Jan;48(1):100157. doi: 10.1016/j.mocell.2024.100157. Epub 2024 Nov 19.
[2] Srebotnik Kirbis I. State of the Art and Science of Immunocytochemistry. Acta Cytol. 2025;69(1):51-59.
[3] Jain D, et al. Diagnostic and Predictive Immunocytochemistry in Lung Cancer. Acta Cytol. 2025;69(1):69-76.
[4] Pinto D, Schmitt FC. Immunohistochemistry Applied to Breast Cytological Material. Pathobiology. 2022;89(5):343-358.
