非洲豬瘟病毒（ASFV）P54 蛋白的介紹及應用
一、基本概念與結構特征
（一）表達方式
- 蛋白定位：主要位于病毒囊膜和內膜結構中，部分暴露于病毒表面，是宿主免疫識別的重要抗原。
- 分子結構：由約 500 個氨基酸組成，分子量約54 kDa（因此命名為 P54），含有多個 α- 螺旋和 β- 折疊結構，形成復雜的三維構象。
- 功能作用：參與病毒粒子的組裝、出芽及宿主細胞融合過程，同時其抗原表位可誘導宿主產生中和抗體和細胞免疫應答。
（一）表達方式
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- 昆蟲細胞 - 桿狀病毒系統：
- 優勢：可實現糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，蛋白構象更接近天然狀態，抗原性強。
- 流程：將 p54 基因克隆至桿狀病毒載體，轉染 Sf9 或 High Five 細胞，通過病毒感染誘導表達，表達量可達 1-5 mg/L。
- 哺乳動物細胞（如 HEK293）：
- 可進一步優化糖基化修飾，但表達效率較低，成本較高，適用于高活性蛋白制備。
- 昆蟲細胞 - 桿狀病毒系統：
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- 可在大腸桿菌中表達 P54 的部分抗原域（如線性表位區域），用于初步抗體篩選或診斷抗原，但因缺乏修飾可能影響構象表位完整性。
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- 親和層析：利用 His 標簽與 Ni²⁺柱結合（重組蛋白），或通過抗 P54 抗體親和柱捕獲天然蛋白，洗脫后純度可達 85% 以上。
- 凝膠過濾層析（Size exclusion chromatography）：
- 分離不同聚合狀態的 P54 蛋白（如單體、多聚體），同時去除雜質，優化蛋白均一性。
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- 根據 P54 蛋白的等電點（pI 約 6.5-7.0）選擇陰離子或陽離子交換柱，去除電荷差異的雜蛋白。
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- SDS-PAGE 條件：8%-12% 分離膠，上樣量 5-10 μg，電泳后可見約 54 kDa 的主條帶，若存在糖基化修飾，可能出現分子量略大的拖帶（54-60 kDa）。
- Western blot 驗證：使用 ASFV 陽性血清或抗 P54 單克隆抗體作為一抗，可檢測蛋白抗原性，常用于病毒感染細胞的蛋白表達分析。
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- 用于分析 P54 蛋白的天然構象和聚合狀態，如是否形成同源多聚體（如二聚體、四聚體），這對其功能研究至關重要。
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- 關鍵表位區域：P54 蛋白的 C 端（如氨基酸 300-500）含有多個構象依賴的中和表位，可誘導宿主產生高效中和抗體；N 端則包含線性表位，用于診斷抗原設計。
- 免疫原性特點：天然 P54 蛋白的免疫原性顯著強于重組蛋白，主要因重組表達中糖基化修飾不足導致構象差異。
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- ELISA 檢測：以重組 P54 蛋白為包被抗原，檢測豬血清中的 ASFV 抗體，尤其適用于急性感染期的抗體篩查，敏感性與 P30 蛋白相當。
- 中和試驗（VNT）：P54 蛋白介導的中和抗體檢測是評估 ASFV 免疫保護的金標準之一。
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- 亞單位疫苗候選抗原：P54 蛋白常與 P30、E183L 等結構蛋白聯合使用，構建多抗原亞單位疫苗，增強免疫保護效果。例如，P54 與 P30 的組合可誘導更廣泛的中和抗體反應。
- 病毒樣顆粒（VLP）疫苗：通過重組表達 P54 與其他結構蛋白（如 M1249L），自組裝成 VLP，模擬天然病毒結構，提升免疫原性。
- 氨基酸序列多態性：不同基因型毒株（如基因型 I、II、XXI 等）的 P54 蛋白存在 5%-10% 的氨基酸差異，尤其在 N 端和中部區域（如高變區）變異更為明顯。
- 抗原性影響：部分變異可能導致中和表位改變，如非洲本土毒株與歐亞流行毒株（如 Georgia 2007/1）的 P54 蛋白在中和抗體結合效率上存在差異，需通過交叉中和試驗驗證疫苗或診斷試劑的跨毒株適用性。
- 代表性毒株對比：
- 蛋白表達與修飾優化：P54 蛋白的正確折疊依賴復雜的翻譯后修飾，需優化真核表達系統（如昆蟲細胞培養條件）以提升活性蛋白得率。
- 變異毒株的適應性：ASFV 的持續進化可能導致 P54 蛋白抗原表位漂移，需定期更新診斷抗原和疫苗抗原的序列設計。
- 與其他蛋白的協同機制：P54 蛋白在病毒感染中的功能（如膜融合）需與其他結構蛋白（如 P72、E199L）的相互作用研究，以闡明其免疫保護的分子基礎。
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