酶標儀上細菌代謝的微生物學應用
在生命科學研究領域，酶標儀是一種應用廣泛的實驗室儀細菌代謝涵蓋了一組復雜且相互關聯的化學反應，這些化學反應維系著細菌的生命活動。在微生物學領域，許多應用都依賴于對酶促反應的監測，或對特定代謝物、酶濃度以及生命分子過程中所涉及的化學反應的測量。這些應用在基礎研究、環境研究、生物技術的不同領域，甚至是藥物開發等方面都具有重要價值。
本文探討了細菌代謝的范圍、其對研究人員的意義，以及如何利用酶標儀進行多種代謝應用的測定。
1 什么是細菌代謝？
細胞從環境中提取能量，并通過高度整合的化學反應和相互作用網絡將較小的分子轉化為細胞成分，這一過程被稱為代謝。代謝的基本策略是形成能量和大型分子前體。細菌代謝指的是在這些生物體內發生的復雜反應。
合成代謝和分解代謝
代謝反應可分為合成代謝（anabolic pathways）和分解代謝（catabolic pathways）（圖1）。合成代謝指從簡單分子合成復雜分子的過程，需要能量輸入。分解代謝則是將碳水化合物、脂肪和蛋白質等復雜分子分解為更簡單的物質（如葡萄糖和氨基酸），并在此過程中釋放能量，以驅動合成代謝過程。
圖1：分解代謝和合成代謝反應
細菌種類繁多，并進化出了多種代謝途徑，使其能適應各種環境。其中一些細菌可以根據環境條件在不同的代謝途徑之間切換，而另一些細菌則高度專一，適應特定且通常要求極為苛刻的環境。
在細菌中，一些常見且重要的代謝途徑包括糖酵解（將葡萄糖轉化為丙酮酸）、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環（TCA循環，涉及碳水化合物、脂肪酸和氨基酸的乙酰輔酶A氧化）、不同類型的發酵、卡爾文循環（光合作用的一部分，從二氧化碳合成葡萄糖），以及固氮作用（將分子態氮轉化為氨）（圖2）。
圖2：細菌生理的化學反應、代謝過程及代謝途徑的簡化示意圖
微生物代謝類型
細菌代謝能力涵蓋有氧呼吸、厭氧呼吸、發酵、光合作用，或通過氧化無機分子（如氨或硫化.氫）獲取能量的代謝方式。根據其代謝途徑的不同，微生物可分為不同的代謝類型。例如，異養微生物（heterotrophic microbes）無法自行合成營養物質，而是依賴有機碳來源獲取能量；自養微生物（autotrophic microbes）則可以利用無機能源（如二氧化碳）合成糖類等儲能物質。光無機營養生物（photolithotrophs）通過氧化無機基質獲取能量，與光有機營養生物（photoorganotrophs）相似，但其氫供體來源不同。
表1：不同類型的微生物及其營養來源
2 為什么要測量細菌代謝？
測量細菌代謝可幫助研究人員掌握多種生物過程，并廣泛應用于多個領域。它們可以為優化發酵過程提供工業用途，例如用于生產抗生素、酶和燃料的發酵過程。僅抗微生物藥物耐藥性這一項，就極大地推動了通過了解細菌代謝和細菌生長來開發新型藥物的新方法。此外，代謝研究對于藥物開發及疾病機制研究也具有重要意義。
3 酶標儀在細菌代謝研究中的應用
研究細菌代謝的方法多種多樣，以下是幾種常見的實際應用，研究人員可直接使用或加以改進。
每條代謝途徑的核心是活性酶及其底物轉化，因此，酶活性可作為細菌代謝的良好檢測指標。例如，在應用報告《通過熒光檢測法監測賴氨酸去乙酰化酶活性》中，研究人員使用CycLex SIRT1試劑盒測定大腸桿菌賴氨酸去乙酰化酶CobB的動力學特性（圖3）。
圖3：賴氨酸去乙酰化酶活性檢測原理示意圖此外，賴氨酸去乙酰化在基因表達調控、蛋白質功能及穩定性控制、以及代謝調節中均發揮重要作用（圖4）。
圖4：大腸桿菌CobB酶動力學特性測定
細菌代謝的另一個重要因素是氧化還原酶。NADH/NAD+和NADPH/NADP+是代謝過程的許多氧化還原酶使用的輔助因子，能夠監測它們的還原情況，從而提供一種可靠的方法來測量它們的活性。在應用說明《ELISA檢測和NADH/NADPH轉換檢測》中，BMG LABTECH檢測儀的紫外-可見分光光度計在快速測定氧化和還原煙酰胺輔因子方面的能力得到了強調（圖5）。NAD+還原為NADH和NADP+還原為NADPH的過程可在340 nm處進行監測。
圖5：NADP⁺/NADPH轉換曲線的吸光度測量數據回歸擬合曲線。紅線是260納米處的測量值擬合，藍線是340納米處的測量值擬合，綠線是340/260納米處的測量值比值擬合氧化代謝過程中會產生活性氧（ROS），其測定可提供關于細胞信號轉導事件的重要信息。這些事件可能會影響基因表達和酶活性調控，并引發細菌代謝的變化。在應用報告《利用熒光分析檢測煙曲霉分離株產生的活性氧》中，研究團隊描述了一種可用于細菌活性氧檢測的熒光檢測方法。
葡萄糖在能量消耗中起著核心作用。葡萄糖還可以通過發酵代謝產生乳酸。因此，葡萄糖和乳酸水平的測量為研究人員提供了特定細菌細胞代謝活動的洞察力。在應用筆記中，葡萄糖測定和乳酸測定可以精確監測細胞葡萄糖代謝，基于化學發光的現有檢測方法被成功地小型化，并可在VANTAstar®酶標儀上讀取（圖6）。VANTAstar酶標儀的動態范圍擴展技術使這些檢測方法易于操作，從反應開始到化學發光讀數，無需人工干預。
圖6：乳酸和葡萄糖發光檢測原理示意圖支原體是一種不尋常的細菌，因為它沒有細胞壁。它們通常是實驗室細胞培養中不受歡迎的污染物，科學家需要快速、準確的方法來確保他們的培養物不受污染。應用說明Lonza的MycoAlert檢測法在BMG LABTECH酶標儀上的應用描述了一種使用特定于其代謝的酶來探測支原體的檢測方法（圖7）。
圖7：MycoAlert™反應的動力學曲線，其中藍色代表無支原體的樣品，紅色代表支原體陽性的樣品
氧含量和pH值是細菌代謝的重要參數。它們直接影響代謝途徑和特定酶的活性，并可能影響細菌的生長。測量氧含量和pH值有助于研究人員更好地控制細菌過程。開放流動呼吸測定法是一種生理相關方法，可用于測量細胞呼吸。在應用報告《通過實時監測細胞外酸化與耗氧量來測量細胞代謝變化》中，該系統被轉換為96孔微孔板格式，從而能夠在生理相關大氣條件下實時測量氧和pH水平。該系統是在配備有大氣控制單元的CLARIOstar®酶標儀上開發的（圖8）。該系統在人類細胞中使用時，可以輕松地用于細菌。
圖8：在10%氧氣環境中的耗氧量。含有HepG2細胞的重復孔用抗.霉.素.A處理
酶標儀具有與細菌代謝研究特別相關的功能。這些功能包括將細菌保持在最佳生長條件下的大氣控制單元和振蕩選項，以及無需人工干預即可可靠探測各種濃度和信號強度的樣本的動態范圍擴展技術。
使用96孔、384孔或1536孔微孔板可同時處理多個樣品。實時測量適用于繪制細菌代謝中可能發生的動態變化。例如，這適用于細菌生長動力學和酶活性的變化。
酶標儀還能夠在各種條件下使用不同的檢測模式進行并行測量。因此，多功能酶標儀在細菌代謝的常規和高級測量中具有速度、可再現性和規模方面的優勢。
4 細菌代謝應用的未來發展
我們對細菌代謝的了解仍在不斷增長。因此，隨著全球實驗室不斷涌現新的發現、技術和應用，未來幾年對細菌代謝測量的需求將繼續增長。酶標儀檢測技術的進一步發展和特定檢測方法的創新應成為未來發展的強大催化劑。
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