利用3D打印口腔溶解膜注射寨卡病毒疫苗的研究應(yīng)用
寨卡病毒 (ZIKV) 屬于黃病毒科，早期 ZIKV 免疫是預(yù)防小腦畸形和吉蘭-巴利綜合征(GBS) 等并發(fā)癥的首要任務(wù)。 與傳統(tǒng)的疫苗接種方法不同，口腔溶解膜（ODF）或粘膜粘附膜技術(shù)是一個(gè)新興的、令人興奮的概念，可用于藥物領(lǐng)域的疫苗設(shè)計(jì)和制劑開發(fā)。 這種有吸引力且新穎的方法可以幫助因疾病或綜合征而患有吞咽困難的患者。 在這項(xiàng)研究中，我們研究了一種微粒寨卡疫苗，通過口腔途徑在薄膜或口腔溶解膜 (ODF) 的幫助下給藥，其中一次初劑量和兩次加強(qiáng)劑量相隔兩周。 在體外，ODF表現(xiàn)出優(yōu)異的理化性質(zhì)，表明該薄膜是疫苗微粒的良好載體，并且與頰粘膜具有生物相容性。 體內(nèi)結(jié)果顯示，針對 ZIKV 特異性免疫具有強(qiáng)大的體液（IgG、IgG1 和 IgG2a 亞型）和 T 細(xì)胞反應(yīng)（CD4+/CD8+）。 Zika MP 疫苗和佐劑 Zika MP 疫苗都會(huì)影響記憶（CD45R/CD27）和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（TNF-α 和 IL-6）的表達(dá)。 在這項(xiàng)研究中，借助 ODF 通過口腔途徑進(jìn)行ZIKV 疫苗接種，證明了開發(fā)無痛傳染病疫苗的巨大前景。
1、引言
由于粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）位于口腔，因此頰部給藥途徑是一種非常有吸引力的疫苗注射方法，可刺激粘膜免疫。雖然口服、鼻腔和肺部疫苗遞送方法已被廣泛討論，但鮮為人知的舌下和口腔途徑受到的關(guān)注相對較少。粘膜組織由于其廣闊的表面積和免疫能力，為疫苗接種和靶向提供了有吸引力的選擇。頰粘膜富含抗原呈遞細(xì)胞，提供了一種對患者友好、無痛的替代方案，可能會(huì)提高疫苗接種率。一旦 ODF 被放置在頰粘膜中，稱為朗格漢斯細(xì)胞和 M 細(xì)胞樣細(xì)胞的 APC 就可以吸收寨卡疫苗 MP（圖 1）。
利用全自動(dòng) 3D 打印工藝進(jìn)行 ODF 制造，我們經(jīng)濟(jì)高效的方法消除了手工勞動(dòng)，確保了可重復(fù)性。這種創(chuàng)新方法有望提高疫苗的可及性、降低成本并簡化疫苗接種過程。
圖1.頰粘膜 ODF 中裝載的寨卡 MP。 一旦 zika MP 從薄膜中釋放出來，MP 就會(huì)被 APC和 M 細(xì)胞樣細(xì)胞吸收以處理 ZkaMP。 處理后，APC 進(jìn)入血液并前往附近的淋巴結(jié),開始與T細(xì)胞接觸，從而對寨卡病毒產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。
2、3D 打印口腔溶解膜 (ODF) 的制備
ODF 的配方涉及使用各種可生物降解的聚合物。首先，使用乙醇作為溶劑制備Kollidon 90F (16.24% w/v) 和Kollidon VA64 (1.06% w/v)。接下來，制備 PEG 2000 (0.6% w/v) 并緩慢添加到先前的混合物中。將該混合物用箔覆蓋并攪拌4小時(shí)。將所得混合物與疫苗微粒一起加載到 CELLINK BIO X3D 生物打印機(jī)（的噴嘴頭上。 G 代碼是為打印 ODF 而創(chuàng)建的。 ODF 配方是在實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備的模具中打印的。該模具是使用適用于兩種聚合物的 SYLGARD 186 有機(jī)硅彈性體套件制備的，并將所得混合物置于 96 孔板的蓋子上以制作模具。將所得混合物與滅活的寨卡病毒微粒一起裝入設(shè)定為室溫 (RT) 和 50 kPa（壓力）的 3D 打印機(jī)中。 3D打印機(jī)完成后，將96孔板放入4℃加熱室中5分鐘，然后放入干燥器中過夜。
3、口腔溶解膜 (ODF) 口腔免疫的體內(nèi)研究設(shè)計(jì)
所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得美世大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì) (IACUC) 協(xié)議 (#A2303001) 的批準(zhǔn)。 SwissWebster (SW) 小鼠，4-6 周齡，獲自 Charles River Laboratories（美國馬薩諸塞州威爾明頓）。如圖 2 所示，小鼠被隨機(jī)分配，并使用口腔溶解膜 (ODF) 通過口腔給藥接受初始劑量和兩次加強(qiáng)劑量。每兩周收集一次血清，通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 測定總 IgG、IgA 和 IgG 亞型（IgG2a、IgG1 和 IgG3）的抗體反應(yīng)。攻擊后，收獲免疫器官（脾、腹股溝和腋窩淋巴結(jié)）并隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分析。
圖2.體內(nèi)研究中的小鼠組 (n=6)(左)。體內(nèi)研究時(shí)間線(右)評估通過口腔途徑施用時(shí)初始劑量、隨后兩劑加強(qiáng)劑量的寨卡 MP 疫苗 ODF 和佐劑寨卡 MP 疫苗ODF 的給藥狀態(tài)。第10周對瑞士韋伯斯特小鼠進(jìn)行攻擊。一周后，即第11周，處死小鼠，收集免疫器官。
4、結(jié)果
使用ODF給藥后，對瑞士小鼠的體液反應(yīng)進(jìn)行了評估。在兩周的時(shí)間里(第2周和第4周)，受試者接受了兩次加強(qiáng)針的注射。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSA)用于分析每周收集的這些樣本[1,2]。lgG抗體是一種血液穩(wěn)定的抗感染藥物，對人體具有長期免疫作用，是最特別的。圖3展示了在瑞士Webstermice中觀察到的寨卡病毒特異性gG滴度。ZIKV疫苗和無佐劑ZIKV疫苗組表現(xiàn)出強(qiáng)烈的總lgG 抗體反應(yīng)。與未治療組相比，第2周至第11周期間lgG滴度顯著升高。值得注意的是，即使在第10周的攻擊后，帶佐劑和未帶佐劑的疫苗接種組的lgG滴度仍然顯著升高。與未接受佐劑的小鼠相比，帶佐劑的zika MP 疫苗在第 2、4、6、8和 11 周誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的!gG 抗體反應(yīng)。 疫苗。此外，還測量了其他抗體，包括IgA和 IgG 亞型(lgG1、lgG2a和IgG3)。
圖3.血清ZIKV特異性IgG滴度ELISA測定[1]。動(dòng)物在第0周接受第一次注射，兩次加強(qiáng)劑分別通過口腔給藥。與未治療對照組(第2、4、6、8和11周)相比，通過ODF接種ZikaMP疫苗和Padiuvant的小鼠表現(xiàn)出顯著更高的耐受滴度。佐劑ZIKV疫苗與ZikaMP疫苗(第2、6、8和11周)相比，產(chǎn)生了顯著更高的耐受滴度
5、總結(jié)
自寨卡病毒在全球爆發(fā)以來，人們一直致力于對抗這種病毒的廣泛研究工作。目前尚無可用的疫苗或治療方案。在我們的概念驗(yàn)證研究中，我們深入研究了一種微粒寨卡疫苗，旨在保護(hù)抗原，同時(shí)提供持續(xù)釋放以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)的基于針頭的方法不同，我們探索了一種在口腔溶解膜(ODF)的幫助下通過口腔免疫接種的無痛寨卡疫苗。探索無痛替代方案可能有助于提高全球的依從性和疫苗接種率。我們的研究結(jié)果表明，寨卡MP疫苗引發(fā)了持續(xù)的抗體反應(yīng)并在佐劑的幫助下增強(qiáng)了細(xì)胞和記憶反應(yīng)。 此外，與現(xiàn)有文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致，可能需要多次接種疫苗才能建立長期免疫和交叉保護(hù)。通過這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，我們證明了配制能夠增強(qiáng)體液和細(xì)胞反應(yīng)的鼻內(nèi)寨卡微粒疫苗的可行性。
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1、引言
由于粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）位于口腔，因此頰部給藥途徑是一種非常有吸引力的疫苗注射方法，可刺激粘膜免疫。雖然口服、鼻腔和肺部疫苗遞送方法已被廣泛討論，但鮮為人知的舌下和口腔途徑受到的關(guān)注相對較少。粘膜組織由于其廣闊的表面積和免疫能力，為疫苗接種和靶向提供了有吸引力的選擇。頰粘膜富含抗原呈遞細(xì)胞，提供了一種對患者友好、無痛的替代方案，可能會(huì)提高疫苗接種率。一旦 ODF 被放置在頰粘膜中，稱為朗格漢斯細(xì)胞和 M 細(xì)胞樣細(xì)胞的 APC 就可以吸收寨卡疫苗 MP（圖 1）。
利用全自動(dòng) 3D 打印工藝進(jìn)行 ODF 制造，我們經(jīng)濟(jì)高效的方法消除了手工勞動(dòng)，確保了可重復(fù)性。這種創(chuàng)新方法有望提高疫苗的可及性、降低成本并簡化疫苗接種過程。
2、3D 打印口腔溶解膜 (ODF) 的制備
ODF 的配方涉及使用各種可生物降解的聚合物。首先，使用乙醇作為溶劑制備Kollidon 90F (16.24% w/v) 和Kollidon VA64 (1.06% w/v)。接下來，制備 PEG 2000 (0.6% w/v) 并緩慢添加到先前的混合物中。將該混合物用箔覆蓋并攪拌4小時(shí)。將所得混合物與疫苗微粒一起加載到 CELLINK BIO X3D 生物打印機(jī)（的噴嘴頭上。 G 代碼是為打印 ODF 而創(chuàng)建的。 ODF 配方是在實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備的模具中打印的。該模具是使用適用于兩種聚合物的 SYLGARD 186 有機(jī)硅彈性體套件制備的，并將所得混合物置于 96 孔板的蓋子上以制作模具。將所得混合物與滅活的寨卡病毒微粒一起裝入設(shè)定為室溫 (RT) 和 50 kPa（壓力）的 3D 打印機(jī)中。 3D打印機(jī)完成后，將96孔板放入4℃加熱室中5分鐘，然后放入干燥器中過夜。
3、口腔溶解膜 (ODF) 口腔免疫的體內(nèi)研究設(shè)計(jì)
所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲得美世大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì) (IACUC) 協(xié)議 (#A2303001) 的批準(zhǔn)。 SwissWebster (SW) 小鼠，4-6 周齡，獲自 Charles River Laboratories（美國馬薩諸塞州威爾明頓）。如圖 2 所示，小鼠被隨機(jī)分配，并使用口腔溶解膜 (ODF) 通過口腔給藥接受初始劑量和兩次加強(qiáng)劑量。每兩周收集一次血清，通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 測定總 IgG、IgA 和 IgG 亞型（IgG2a、IgG1 和 IgG3）的抗體反應(yīng)。攻擊后，收獲免疫器官（脾、腹股溝和腋窩淋巴結(jié)）并隨后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分析。
圖2.體內(nèi)研究中的小鼠組 (n=6)(左)。體內(nèi)研究時(shí)間線(右)評估通過口腔途徑施用時(shí)初始劑量、隨后兩劑加強(qiáng)劑量的寨卡 MP 疫苗 ODF 和佐劑寨卡 MP 疫苗ODF 的給藥狀態(tài)。第10周對瑞士韋伯斯特小鼠進(jìn)行攻擊。一周后，即第11周，處死小鼠，收集免疫器官。
4、結(jié)果
使用ODF給藥后，對瑞士小鼠的體液反應(yīng)進(jìn)行了評估。在兩周的時(shí)間里(第2周和第4周)，受試者接受了兩次加強(qiáng)針的注射。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELSA)用于分析每周收集的這些樣本[1,2]。lgG抗體是一種血液穩(wěn)定的抗感染藥物，對人體具有長期免疫作用，是最特別的。圖3展示了在瑞士Webstermice中觀察到的寨卡病毒特異性gG滴度。ZIKV疫苗和無佐劑ZIKV疫苗組表現(xiàn)出強(qiáng)烈的總lgG 抗體反應(yīng)。與未治療組相比，第2周至第11周期間lgG滴度顯著升高。值得注意的是，即使在第10周的攻擊后，帶佐劑和未帶佐劑的疫苗接種組的lgG滴度仍然顯著升高。與未接受佐劑的小鼠相比，帶佐劑的zika MP 疫苗在第 2、4、6、8和 11 周誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的!gG 抗體反應(yīng)。 疫苗。此外，還測量了其他抗體，包括IgA和 IgG 亞型(lgG1、lgG2a和IgG3)。
5、總結(jié)
自寨卡病毒在全球爆發(fā)以來，人們一直致力于對抗這種病毒的廣泛研究工作。目前尚無可用的疫苗或治療方案。在我們的概念驗(yàn)證研究中，我們深入研究了一種微粒寨卡疫苗，旨在保護(hù)抗原，同時(shí)提供持續(xù)釋放以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)的基于針頭的方法不同，我們探索了一種在口腔溶解膜(ODF)的幫助下通過口腔免疫接種的無痛寨卡疫苗。探索無痛替代方案可能有助于提高全球的依從性和疫苗接種率。我們的研究結(jié)果表明，寨卡MP疫苗引發(fā)了持續(xù)的抗體反應(yīng)并在佐劑的幫助下增強(qiáng)了細(xì)胞和記憶反應(yīng)。 此外，與現(xiàn)有文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致，可能需要多次接種疫苗才能建立長期免疫和交叉保護(hù)。通過這項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，我們證明了配制能夠增強(qiáng)體液和細(xì)胞反應(yīng)的鼻內(nèi)寨卡微粒疫苗的可行性。
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