一．納米抗體免疫文庫

構建免疫文庫最為特殊而重要的步驟是動物免疫，使駱駝重鏈V區胚系基因片段V、D和J在CDR3結構域隨機位點處發生組合性重排。促使駱駝身體產生特異性重鏈抗體的方法類似于從其它動物中獲取傳統抗體，主要是周期性的連續給動物注射偶聯有佐劑的抗原一段時間，使機體對抗原產生充分的免疫反應以生成特異性強、親和力高的重鏈抗體。免疫結束后，從駱駝血液中分離淋巴細胞，提取總RNA，再以RNA為模版，進行反轉錄得到cDNA文庫；根據重鏈抗體保守區域設計引物，采用巢式PCR技術經過2-3輪PCR擴增VHH基因片段，同時引入合適的酶切位點（如PstI和NotI）。接著，將VHH基因克隆到噬菌粒載體（如pHEN4和pMECS）上，與噬菌體基因II蛋白（gIIp）融合表達，從而展示在噬菌體表面以供特定的抗原識別篩選。再將重組的噬菌粒載體轉化入大腸桿菌細胞并進行文庫擴增，從而形成抗原傾向性的免疫文庫刀。文庫的質量一般可以從文庫庫容和多樣性等方面進行評估。

二．納米抗體噬菌體展示文庫的構建

1.TG1電轉感受態的制備

（1）將TG1細胞劃線培養在LB板上，37 °C倒置培養過夜；

（2）挑取單個克隆接種在5 mL 2xTY培養基中，37 °C培養過夜；

（3）接種2 mL過夜培養的菌液至300 mL 2xTY培養基中，37 °C, 220 rpm培養至0D600為1左右；

（4）將菌液放在冰中1 h，1 h后將菌液轉移至離心管中， 4 °C， 4000 rpm離心15 min;5)棄上清，加入等體積的1 mM，pH 7.0的Hepes溶液(冰上預冷)重懸菌體， 4 °C，4000 rpm離心15 min；

（6）加入1/2體積的10%甘油重懸菌體，4 °C，4000 rpm離心15 min；

（7）棄上清,每個管中加入10 mL 10%甘油重懸菌體， 4 °C， 4000 rpm離心15 min，棄上清，用槍吸去殘留液，加入10%甘油至終體積1 mL。

2.TG1感受態細胞轉化效率檢測

（1）取2 μL pMECS質粒（10 ng/μL）加入到48 μL制備好的TG1感受態細胞，輕彈混勻，置冰上1 min。

（2）轉入電擊杯中（-20 °C預冷），電壓設置為1700 V，進行電轉，電轉完立即用800 μL 37°C預熱的SOC培養基混勻吸出，轉至試管中；

3) 37 °C, 220 rpm搖床培養1 h,取出菌液,梯度稀釋,最終取100 μL涂在LA+GLU板上，37 C培養過夜，計算轉化效率;

3.噬菌體納米抗體文庫的形成

（1）感受態轉化效率檢測完成后，將100 μL的連接產物加至1 mL的電轉TG1感受態中，混勻；

（2）在每個電擊杯中(-20 °C預冷)分裝40 μL感受態，將電擊杯置入電轉儀，1700V電擊，使重組噬菌粒進入感受態細胞；

（3）電擊結束后加入SOC培養基1 mL，吹打電擊杯，轉入37 °C預熱的錐形瓶中，最后再用2 mL SOC培養基將所有電擊杯洗刷一-次，轉入錐形瓶，37 °C搖床培養1 h；

（4）1h后，將菌液收集到50mL離心管，25°C，4000rpm離心10min，用5mLSOC重懸菌體，取出50 μL用以梯度稀釋，以便測定庫容。其余菌液平均涂在10個LA+GLU板.上，37°C，培養16 h；

（5）將培養好的板取出，每個板加入5 mL液體LB培養基，用涂布棒將菌體刮下，倒入錐形瓶，再用3 mL LB沖洗-遍板，并入錐形瓶；

（6）將菌液轉入50 mL離心管，25 °C，4000 rpm離心10 min,棄上清。加入30 mL15%甘油+LB液體培養基，漩渦振蕩重懸，分裝于1.5 mL EP管，-80 °C保存備用。

圖1 文庫構建流程

三．噬菌體構建技巧

噬菌體文庫的庫容量和多樣性是衡量文庫質量的重要標準之一，容量越大、多樣性越好的庫是成功篩選出納米抗體的有效保證；

影響文庫容量和多樣性的關鍵點包括：提取RNA過程中RNA的降解、反轉錄過程中的模板和引物、擴增過程中引物的選擇和模板的用量以及PCR擴增輪數、感受態細菌的轉化效率、連接體系的大小等因素。

泰克生物可為客戶提供來自駝源VHH納米抗體庫，以及其他物種scFv形式抗體的酵母展示文庫構建及篩選服務。VHH納米抗體庫，又稱為駝源重鏈抗體文庫，抗體分子量大小為15kDa，是駝源動物產生的特有的一種抗體。酵母抗體文庫展示體系受限于自身物理特性限制，物理庫容滴度一般<107，因此主要應用于客戶對項目庫容要求不高，動物免疫后PBMC細胞經過二次分選以及避免漏掉二硫鍵形成的抗體發現項目。同時酵母展示文庫相對噬菌體展示文庫技術而言，前者在微量抗體表達后抗體活性層面相較于后者要高，得益此基礎，在流式篩選時就能區分抗體的親和力高低。

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