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生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響

瀏覽次數:1296 發布日期:2022-4-2  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
 

甲醇蛋白是以甲醇、磷酸等作為培養基,通過發酵形成的甲醇酵母細胞為單細胞菌體,再經提煉形成單細胞蛋白。從甲醇酵母細胞中所提取的單細胞蛋白產品安全無毒,其豐富的氨基酸含量是其他植物性原料所無法比擬的,是一種營養價值非常高的蛋白質產品。單細胞甲醇蛋白胞內可溶性蛋白質占細胞總蛋白質的比例達 95%以上。但是甲醇酵母細胞是由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質等組成的網絡結構,且胞壁較厚,結構堅韌,所以大部分并沒有破壁,不利于胞內蛋白質提取。如果將其直接進行蛋白質提取,收率很低。而且提取物里面還含有大量的磷脂、核酸和多糖等雜質。因此,目前這類甲醇蛋白粗品主要作為飼料添加劑使用。
   本文利用甲醇蛋白粗品經過堿溶、離心、破壁、酸沉制取純化甲醇蛋白,研究了適合于甲醇酵母細胞破壁及純化胞內蛋白質的方法,為甲醇蛋白的有效利用提供實驗依據。

儀器和原料
    高壓均質機NanoDeBEE(蘇州微流納米生物技術有限公司);Q/SGYM1008電子天平;BD-1A-70冷凍干燥機;Delta320酸度計:梅特勒-托利多公司;TDL-5A離心機;DKS24恒溫水浴鍋;SHA-B水浴恒溫振蕩器。甲醇蛋白粗品:粗蛋白質50% 粗脂肪11.5%粗纖維7.4%水分18.5%粗灰分12.6%;酵母破壁酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司);其他試劑均為分析純。

試驗方法
   1.生物酶解處理:量取25%甲醇蛋白粗品溶液500mL,調節pH4.5后分裝成5份,每份100mL。在甲醇蛋白粗品溶液中分別加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的酵母破壁酶,在水浴恒溫振蕩器中50℃保溫12h。酶解結束后,測定細胞破壁率,然后離心收集上清液,并測定其中蛋白質含量。
   2.熱堿處理:量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL,調節pH至7.0、8.0、9.0、10.0和11.0,分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h,每隔10min攪拌1次。熱堿處理結束后,測定細胞破壁率,然后離心收集上清液,并測定其中蛋白質含量。
   3.高壓均質處理。量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL,在高壓均質機中進行高壓均質破壁,高壓均質壓力分別為80、120、160、200和240MPa。高壓均質處理結束后,測定細胞破壁率,然后離心收集上清液,并測定其中蛋白質含量。
   4.熱堿-均質處理:量取2份25%甲醇蛋白粗品溶液各200mL,調節pH至9.0、10.0后,分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h進行熱堿處理。熱堿處理結束后分裝成4份,每份100mL,分別在80、120、160、200和240MPa下進行均質處理。均質結束后,測定細胞破壁率,然后離心收集上清液,并測定其中的蛋白質含量。
   5.甲醇蛋白酸沉純化:最取5份500mL25%甲醇蛋白粗品溶液,選擇適合甲醇蛋白細胞破壁處理方法,處理結束后離心收集上清液,用鹽酸分別將上清液調節pH至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0,靜置20min后,5000r/min下離心10min,即獲得蛋白沉淀。將蛋白沉淀冷凍干燥后稱重,并測定蛋白沉淀中粗蛋白質含量。


實驗結果
   酵母破壁酶是由β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶及幾丁質酶等復配而成,可降解細胞壁多糖,使胞內蛋白質釋放出來。圖1為生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁效果的影響曲線。
                    
                                圖1生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響
   從圖1可以看出,隨酶用量增加,甲醇蛋白細胞破壁率不斷上升,酶用量在0.01%~0.04%時,細胞破壁率快速上升,蛋白釋放量也迅速增加。但當酶用量大于0.04%時,上升趨勢減緩,蛋白釋放量增加不明顯。但總體來看,生物酶解處理對酵母細胞破壁效果較差,最大破壁率僅約22%,蛋白釋放量也較低。
                      
                                圖2熱堿處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響
   從圖2可以看出,pH低于8.0時,破壁效果較差。當pH升高,細胞破壁率迅速上升,在pH11.0時,細胞破壁率高達36.2%。蛋白釋放量與細胞破壁率變化趨勢一致。實驗發現,當對甲醇蛋白粗品溶液熱處理時間延長及堿性增強時,純化蛋白顏色也不斷加深,并伴隨有硫化物的特殊氣味,這可能是由于胞內蛋白質釋放出來后,部分二硫鍵斷裂,與堿反應變性所致。當均質壓力增大至160MPa,細胞破壁率快速上升,蛋白釋放量也迅速增加。 
   結果表明,熱堿與高壓均質聯合處理法較生物酶解處理法、熱堿處理法及高壓均質處理法對細胞破壁效率高。綜合生產成本及提純蛋白的用途和性質等因素,本研究獲得了熱堿-均質處理的最適條件:采用Ph10.0,60℃熱處理2h,160MPa壓力均質3次,細胞破壁率可達97.6%;在pH4.5時,破壁后上清液蛋白沉淀量最大,所得純化甲醇蛋白中粗蛋白質含量達到82.5%,純化效果較為理想。

發布者:蘇州微流納米生物技術有限公司
聯系電話:18550201458
E-mail:willnano@163.com

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