生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響
甲醇蛋白是以甲醇、磷酸等作為培養基，通過發酵形成的甲醇酵母細胞為單細胞菌體，再經提煉形成單細胞蛋白。從甲醇酵母細胞中所提取的單細胞蛋白產品安全無毒，其豐富的氨基酸含量是其他植物性原料所無法比擬的，是一種營養價值非常高的蛋白質產品。單細胞甲醇蛋白胞內可溶性蛋白質占細胞總蛋白質的比例達 95%以上。但是甲醇酵母細胞是由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質等組成的網絡結構，且胞壁較厚，結構堅韌，所以大部分并沒有破壁，不利于胞內蛋白質提取。如果將其直接進行蛋白質提取，收率很低。而且提取物里面還含有大量的磷脂、核酸和多糖等雜質。因此，目前這類甲醇蛋白粗品主要作為飼料添加劑使用。
本文利用甲醇蛋白粗品經過堿溶、離心、破壁、酸沉制取純化甲醇蛋白，研究了適合于甲醇酵母細胞破壁及純化胞內蛋白質的方法，為甲醇蛋白的有效利用提供實驗依據。
儀器和原料
高壓均質機NanoDeBEE(蘇州微流納米生物技術有限公司);Q/SGYM1008電子天平;BD-1A-70冷凍干燥機;Delta320酸度計:梅特勒－托利多公司;TDL-5A離心機;DKS24恒溫水浴鍋;SHA－B水浴恒溫振蕩器。甲醇蛋白粗品:粗蛋白質50% 粗脂肪11.5%粗纖維7.4%水分18.5%粗灰分12.6%；酵母破壁酶（廣西南寧龐博生物工程有限公司）;其他試劑均為分析純。
試驗方法
1.生物酶解處理：量取25%甲醇蛋白粗品溶液500mL，調節pH4.5后分裝成5份，每份100mL。在甲醇蛋白粗品溶液中分別加入0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的酵母破壁酶，在水浴恒溫振蕩器中50℃保溫12h。酶解結束后，測定細胞破壁率，然后離心收集上清液，并測定其中蛋白質含量。
2.熱堿處理：量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，調節pH至7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h，每隔10min攪拌1次。熱堿處理結束后，測定細胞破壁率，然后離心收集上清液，并測定其中蛋白質含量。
3.高壓均質處理。量取5份25%甲醇蛋白粗品溶液各100mL，在高壓均質機中進行高壓均質破壁，高壓均質壓力分別為80、120、160、200和240MPa。高壓均質處理結束后，測定細胞破壁率，然后離心收集上清液，并測定其中蛋白質含量。
4.熱堿－均質處理：量取2份25%甲醇蛋白粗品溶液各200mL，調節pH至9.0、10.0后，分別置于60℃的恒溫水浴中保溫2h進行熱堿處理。熱堿處理結束后分裝成4份，每份100mL，分別在80、120、160、200和240MPa下進行均質處理。均質結束后，測定細胞破壁率，然后離心收集上清液，并測定其中的蛋白質含量。
5.甲醇蛋白酸沉純化:最取5份500mL25%甲醇蛋白粗品溶液，選擇適合甲醇蛋白細胞破壁處理方法，處理結束后離心收集上清液，用鹽酸分別將上清液調節pH至3.0、3.5、4.0、4.5和5.0，靜置20min后，5000r/min下離心10min，即獲得蛋白沉淀。將蛋白沉淀冷凍干燥后稱重，并測定蛋白沉淀中粗蛋白質含量。
實驗結果
酵母破壁酶是由β－葡聚糖酶、甘露聚糖酶及幾丁質酶等復配而成，可降解細胞壁多糖，使胞內蛋白質釋放出來。圖1為生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁效果的影響曲線。
圖1生物酶解處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響
從圖1可以看出，隨酶用量增加，甲醇蛋白細胞破壁率不斷上升，酶用量在0.01%～0.04%時，細胞破壁率快速上升，蛋白釋放量也迅速增加。但當酶用量大于0.04%時，上升趨勢減緩，蛋白釋放量增加不明顯。但總體來看，生物酶解處理對酵母細胞破壁效果較差，最大破壁率僅約22%，蛋白釋放量也較低。
圖2熱堿處理對甲醇蛋白細胞破壁的影響
從圖2可以看出，pH低于8.0時，破壁效果較差。當pH升高，細胞破壁率迅速上升，在pH11.0時，細胞破壁率高達36.2%。蛋白釋放量與細胞破壁率變化趨勢一致。實驗發現，當對甲醇蛋白粗品溶液熱處理時間延長及堿性增強時，純化蛋白顏色也不斷加深，并伴隨有硫化物的特殊氣味，這可能是由于胞內蛋白質釋放出來后，部分二硫鍵斷裂，與堿反應變性所致。當均質壓力增大至160MPa，細胞破壁率快速上升，蛋白釋放量也迅速增加。
結果表明，熱堿與高壓均質聯合處理法較生物酶解處理法、熱堿處理法及高壓均質處理法對細胞破壁效率高。綜合生產成本及提純蛋白的用途和性質等因素，本研究獲得了熱堿－均質處理的最適條件:采用Ph10.0，60℃熱處理2h，160MPa壓力均質3次，細胞破壁率可達97.6%;在pH4.5時，破壁后上清液蛋白沉淀量最大，所得純化甲醇蛋白中粗蛋白質含量達到82.5%，純化效果較為理想。
