使用基于ATF的補料分批/灌流混合工藝進行病毒疫苗生產

來自德國馬克斯·普朗克復雜技術系統動力學研究所和ProBioGen AG等的科學家們在2019年第103期的《Applied Microbiology and Biotechnology》雜志上發表了題為“High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system”的文章。文中，研究人員提出了一種在高細胞密度工藝中提高MVA（修飾的安卡拉痘苗病毒）產率的培養策略。該策略基于此前研究人員在搖瓶培養中開發的方法，在臺式生物反應器中建立，包括AGE1.CR.plX細胞在化學限定培養基中懸浮培養至高細胞密度，然后以MVA-CR19病毒株感染。首先，建立灌流策略，以優化細胞生長階段。其次，初始感染階段選擇補料分批策略，以促進病毒攝入和細胞間的傳播。最后，再切換為灌流，為病毒增殖晚期連續提供營養物。該補料分批/灌流混合策略獲得最大感染性滴度為1.0 x 10^10 IU/mL，相比傳統批次培養，產物滴度可提高一個數量級。最后，從生產滅活疫苗考慮，將該策略用于生產流感A/PR/8/3（H1N1）病毒，使用相同的培養系統，可達到3.8 × 10^10 virions/mL的總數。總體來講，使用相同的系統，可獲得與傳統批次培養相當或更高的細胞特異性病毒產量和單位體積產率。此外，大多數病毒顆粒在培養上清中，可簡化下游操作，特別是MVA病毒。研究人員總結認為該策略有助于新的病毒疫苗生產方法的開發。

實驗：生物反應器培養

CR.pIX細胞以0.8-10^6cells/mL的密度接種1L 臺式生物反應器，工作體積0.6-0.8L。生物反應器操作條件設置為37℃、pH 7.2、攪拌速度 120-160rpm，以20μm微泡控制DO為40%。細胞開始以批次模式培養，當葡萄糖濃度達到14-17mM時（接種后60-72h），開始灌流。灌流使用XCell ATF 2系統，以C24控制器控制，流速設置為1.0L/min，并以確定的灌流速率進行操作，以達到＞25 x 10^6cells/mL的細胞密度。

在細胞生長階段，灌流速率每12或24h手動調節。操作時，離線檢測活細胞密度，計算取樣時間點的相應流速，確保CSPR為0.06nL/cell/day，這是CR.pIX細胞基于其葡萄糖消耗速率的最佳置換速率。根據最高細胞特異性生長速率μ=0.026h-1，計算12或24h后的預期活細胞密度和相應的灌流速率。使用BIOSTAT B plus模塊的級聯控制，可獲得采樣時間點之間的線性曲線。感染前2h，使用ATF系統，以新鮮培養基置換1個反應器體積。

培養置換后，生物反應器感染MVA-C19或流感A病毒A/PR/8/34（H1N1）。對于MVA-CR19病毒，使用2種補液程序加上灌流程序，命名為混合工藝1和混合工藝2，以優化在高細胞密度條件下的病毒增殖。對于混合工藝1，廢棄部分細胞懸液，以0.3L的細胞懸液開始病毒生產階段。病毒感染后，加入0.15L新鮮培養基，立即開始補料分批，在感染后12h再補液0.15L，感染后24小時，補液0.3L。最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進行灌流。病毒顆粒（200-400 nm）使用與細胞生長階段相同的ATF中空纖維組件進行收獲。相似的，對于混合工藝2，在病毒感染后立即補液0.2L，之后在感染后24h，補液0.25L，最后，在感染后36-120h，以1vvd的速率進行灌流。為提高病毒收獲，在感染后36小時，將細胞生長階段使用的0.2μm中空纖維組件替換為新的更大孔徑組件。對于流感病毒A生產，評估了一種與MVA-CR19病毒相似的混合策略。

詳細內容，請參考原文。

原文：D.Vazquez-Ramirez, I.Jordan, V.Sandig, High titer MVA and influenza A virus production using a hybrid fed-batch/perfusion with an ATF system. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 3025-3035.

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