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Western blotting之樣品制備注意事項

瀏覽次數:4011 發布日期:2019-5-7  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

無論你是處理細胞還是組織樣本,蛋白提取都是一個很艱難的過程。要么使用物理方法將細胞破碎或者使用化學試劑處理細胞進行裂解。如果第一步提取就搞砸的話,那么長時間小心翼翼培養的細胞就會完全浪費。這里有一些建議可以幫助你進行樣品的抽提。

頭號公敵:蛋白酶
無論您選擇哪種提取方法,蛋白酶都將是一個主要的關注點。當你需要的時候,蛋白酶是很有用的,但是如果你不需要,它們會在短時間內降解目標蛋白。在細胞被胰蛋白酶消化后,在裂解前徹底清洗去除所有的胰蛋白酶。同樣的道理也適用于組織,在溶解前要徹底清洗,以清除殘留的血液,其中也含有蛋白酶。清洗之后細胞是干凈的,準備裂解,要添加蛋白酶抑制劑到裂解緩沖液中。使用蛋白酶抑制劑,并保持樣本在冰上,以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白,也可以添加磷酸酶抑制劑。
 
物理vs.化學方法破碎細胞
物理裂解方法包括超聲、均質、反復凍融和機械破碎(研磨、切碎和碾壓)。當不想把化學和酶引入到提取系統中,物理裂解是理想的。然而,專業設備的要求往往會使過程不一致,難以擴大規模,成本過高。由于物理方法有關的壓力和溫度很高,因此還必須小心避免蛋白變性和聚集。在整個過程中,把所有的東西都預先冷卻,并保持樣品的低溫狀態。
如果您無法使用物理方法裂解細胞,請不要擔心。有很多抽提試劑可以幫助提取蛋白。試劑裂解法因其操作簡便、蛋白提取量高、穩定性好、價格低廉等優點而日益受到人們的歡迎。試劑裂解法的主要缺點是一些鹽和去垢劑等干擾下游分析。如果進行蛋白功能研究,在選擇緩沖液和去垢劑時需要謹慎。

Apexbio蛋白的抽提試劑

去垢劑的選擇
如果抽提的樣品量大,添加SDS和其他離子去垢劑到你的緩沖液將是你最好的選擇。對于Western blotting,使用含有SDS的緩沖液是理想的,例如1X RIPA,因為它在溶解細胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然構象中正常發揮作用,最好使用溫和的提取方法,使用非離子去垢劑,如NP-40或Triton X-100。
濃度測定:最后,使用Bradford、BCA或Lowry進行蛋白的測定,進行蛋白的等量上樣。

發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
聯系電話:0512--86860010
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