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從樣本制備和轉印過程提高western blot的準確性

瀏覽次數:5114 發布日期:2018-12-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
適當樣本準備

樣品準備不當,會讓你頭疼不已,當準備裂解液時:
  • 快速工作
  • 保持低溫環境
  • 增加蛋白酶
  • 進行分裝,避免反復凍融
如果要分裝樣品,請確保等量分裝,以便檢查是否在此過程中丟失了目標。 如果您分離的樣品濃度非常低,請記住,使用高靈敏度底物和較少的裂解液。
如果你的裂解液中含有大量的DNA,它就會變得粘稠。 大量的DNA會使樣品難以移液,并且可能會在凝膠上產生條紋或污跡。 如果是這種情況,請確保在添加上樣緩沖液之前將DNA酶添加到裂解液中。
對于變性凝膠,不要忘記在電泳前將樣品在98°C加熱5分鐘。 這樣可以使樣品完全變性并確保得到干凈銳利的條帶。
 
一些技巧可供參考:
使用過濾后的緩沖液,在電泳前仔細檢查緩沖液,以確保緩沖液不會隨著時間的推移而沉淀。
當取下凝膠梳子時,請非常緩慢地進行,以免孔塌陷或扭曲。
使用上樣器進行上樣。 在上樣時,確保將尖端盡可能靠近孔的底部,緩慢的加入樣品,同時小心地將上樣器取出。
在每個孔中加載相同的體積,不要空位。
低電壓慢跑,特別是最初濃縮樣品時。
·    電泳完成后,使用干凈的刀片切除凝膠的孔和底部凝膠。 這些會導致輕微的高度差異,可能會干擾轉印。

轉印

轉印是將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉移到膜上的過程。
  • 確保“三明治”的所有材料尺寸相同。 濾紙,膜和凝膠都應該是完美的選擇。 這樣可以防止討厭的氣泡出現在你的膜上。
  • 從膠板中取出凝膠時,不要拉伸凝膠。 用刀片從凝膠上取下底部和孔后,在凝膠上放置幾片預先濕潤的濾紙,輕輕地將其弄平。 濾紙將作為支撐,小心地剝離凝膠。
·    確保圓形工具驅趕氣泡。 動作要輕柔,以免扭曲凝膠。

有很多事情可以在這里出錯。
選擇適當的標準化策略。 讓我們面對現實,無論你多么小心,都可能會得到一個有缺陷的凝膠或膜,這將毀了你的一天實驗。 但是,如果您使用總蛋白質染色或加載對照抗體來標準化您的數據,您可以挽救您的實驗。例如使用AzureRed總蛋白染色劑,兼容下游western blot實驗,配合sapphire 雙模式多光譜成像系統,可進行多重熒光檢測,定量更準確,使用更方便。
確保目標和內參具有相同的線性范圍。 化學發光是半定量成像,避免飽和尤其重要。
選擇經過充分驗證并在文獻中引用的高質量一抗。
使用合適的底物以避免信號飽和。 Azure為您提供Radiance和Radiance plus化學發光底物,以滿足您的所有靈敏度需求。
考慮合適的背景去除方法,準確定量條帶。
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發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
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