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| SNP基因分型高通量檢測方法新思路 | |||
單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。單核苷酸多態性是基因組上單個核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。 近年來，單核苷酸多態性研究備受關注。由于個體間核苷酸序列存在很大差異，SNP的數量幾乎是無限的，且每個SNP可能是潛在的有用標記。SNP標記的潛力已在人類基因分型中得到很好的展示。雖然此技術廣泛應用于人類和動物基因組分析，但在植物上仍處于起步階段，目前在水稻、玉米、大豆等作物研究中應用較多。研究表明，作物基因組序列均含有豐富的SNP，對其進行SNP研究，有利于揭示作物生長發育規律，而新的檢測技術也促進了以SNP 為核心的高通量基因分型技術的發展，極大地推動了農作物在遺傳、種質鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。 隨著SNP研究的日益增多，相關的檢測技術也層出不窮，競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）便是其中之一，可在廣泛的基因組DNA 樣品中（甚至是一些復雜基因組的DNA 樣品），對SNP和特定位點上的插入、缺失進行精準的雙等位基因判斷，此方法利用2個熒光探針、2個通用淬滅探針，再加多個位點特異探針來檢則多個SNP位點，原理上類似Taqman檢測，也是基于終端熒光讀取判斷，每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型，但與Taqman技術不同的是，它不需要每個SNP位點都去合成特異的熒光引物，基于自己獨特的ARM PCR原理，讓所有的位點檢測最終都使用通用熒光引物擴增，大大降低了KASP的試劑成本，比Taqman具有更好的位點適應性，所以在醫學、農學檢測方面都有非常好的應用。 KASP方法的樣品一般可放于多孔板中如96孔板，非常適合在具有熒光檢測功能的酶標儀上進行熒光信號的讀取，以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶標儀中讀取KASP樣品產生的熒光信號后所繪制的散點圖： | |||
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| 上左圖：FAM、HEX和兩者的混合物的相對熒光強度與ROX進行標準化且標準化值在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖。如圖所示，得到了三個不同的集群。 上右圖：ROX標準化的DNA擴增樣品熒光在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖。三個顯著的集群被檢測出來。FAM純合子位置靠近X軸，而HEX純合子則位置靠近Y軸，包含FAM和HEX的雜合樣品所形成的的集群在兩個純合子集群之間。無模板對照形成的集群靠近坐標0點位置。所得數據與供應商驗證試劑盒基因分型結果高度一致。 |
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