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MD應用文章下載:SNP基因分型高通量檢測方法新思路

瀏覽次數:4984 發布日期:2018-5-11  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

SNP基因分型高通量檢測方法新思路

單核苷酸多態性
(single nucleotide polymorphism,
SNP),主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種,占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在,平均每500~1000個堿基對中就有1個,估計其總數可達300萬個甚至更多。單核苷酸多態性是基因組上單個核苷酸的變異,包括置換、顛換、缺失和插入。

近年來,單核苷酸多態性研究備受關注。由于個體間核苷酸序列存在很大差異,SNP的數量幾乎是無限的,且每個SNP可能是潛在的有用標記。SNP標記的潛力已在人類基因分型中得到很好的展示。雖然此技術廣泛應用于人類和動物基因組分析,但在植物上仍處于起步階段,目前在水稻、玉米、大豆等作物研究中應用較多。研究表明,作物基因組序列均含有豐富的SNP,對其進行SNP研究,有利于揭示作物生長發育規律,而新的檢測技術也促進了以SNP 為核心的高通量基因分型技術的發展,極大地推動了農作物在遺傳、種質鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。

隨著SNP研究的日益增多,相關的檢測技術也層出不窮,競爭性等位基因特異性
PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP
)便是其中之一,可在廣泛的基因組DNA 樣品中(甚至是一些復雜基因組的DNA 樣品),對SNP和特定位點上的插入、缺失進行精準的雙等位基因判斷,此方法利用2個熒光探針、2個通用淬滅探針,再加多個位點特異探針來檢則多個SNP位點,原理上類似Taqman檢測,也是基于終端熒光讀取判斷,每孔采用雙色熒光檢測一個樣本的一個位點可能的兩種基因型,但與Taqman技術不同的是,它不需要每個SNP位點都去合成特異的熒光引物,基于自己獨特的ARM PCR原理,讓所有的位點檢測最終都使用通用熒光引物擴增,大大降低了KASP的試劑成本,比Taqman具有更好的位點適應性,所以在醫學、農學檢測方面都有非常好的應用

KASP
方法的樣品一般可放于多孔板中如96孔板,非常適合在具有熒光檢測功能的酶標儀上進行熒光信號的讀取,以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶標儀中讀取KASP樣品產生的熒光信號后所繪制的散點圖:

 
       
上左圖:FAM、HEX和兩者的混合物的相對熒光強度與ROX進行標準化且標準化值在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖。如圖所示,得到了三個不同的集群。


上右圖:ROX標準化的DNA擴增樣品熒光在SoftMax Pro軟件中繪制散點圖。三個顯著的集群被檢測出來。FAM純合子位置靠近X軸,而HEX純合子則位置靠近Y軸,包含FAM和HEX的雜合樣品所形成的的集群在兩個純合子集群之間。無模板對照形成的集群靠近坐標0點位置。所得數據與供應商驗證試劑盒基因分型結果高度一致。

       
 

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