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上樣質控和抗體驗證用于Western blot定量

瀏覽次數:4474 發布日期:2018-1-2  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

今天的帖子的靈感來自于我和同事在教他們SDS-PAGE和western blot的實驗交談中。 他們對于qRT-PCR(R)和流式細胞術(R)精通,特別關心如何以及為什么使用某些上樣質控,還有其它的技術被使用驗證,蛋白質表達和抗體特異性的變化。

樣品準備和上樣質控

理想地,上樣質控是多步驟過程的一部分,以確保將標準量的蛋白加載到所分析的每個樣品的凝膠上。 分離樣品的第一步通常是進行蛋白測定,BCA和Bradford測定法是最流行的兩種,允許在開始測定之前標準化樣品濃度。 第一步的幾個技術問題,排除污染物質的干擾,準備或者分離樣本。 考慮到這個原因,應與蛋白質測定一起考慮其預分離標準化技術,例如使用恒定樣品量或細胞數。

一旦樣品開始分離和轉移,經常被忽視的對照是要進行膜染色,我在前一篇文章中討論過。 免染膠和麗春紅染色是檢驗轉移效率的一種很好的驗證技術,但是如果加載了相等量的樣品,樣品也應該看起來大致相似。 利用現代圖像采集和分析技術,還可以使用麗春紅(R),考馬斯藍(R)和免染方法(R)進行基于蛋白質(R)的總蛋白定量。 然而,由于在轉印后進行麗春紅染色,與PVDF和硝酸纖維素膜結合,并且也很容易洗掉,因此很難將其推薦到其他技術上。

所以,加載上樣質控。 大多數人都喜歡用beta-actin和GAPDH作為內參。 然而,應該考慮組織類型,感興趣的蛋白定位和大小,因為在文獻中有許多實例證明加載內參確實變化很大(R,R,R)。 這是一個很好的資源,詳細說明了一些加載內參以及其分子量和細胞定位,但是需要閱讀文獻來評估以前的研究。

然而,在樣品制備和分析western blot定量過程中執行所有三個質控步驟,蛋白定量應變得輕而易舉,特別是如果使用生物成像系統進行多重標記成像,允許上樣質控和感興趣的樣品同時顯現,總蛋白定量和校正。

 

Western blotting中的抗體質控

抗體對照,在Western blotting中,與FACS或免疫組織化學(IHC)等其他基于抗體的技術相比,這一領域通常被忽略。 部分原因是由于電泳期間蛋白質的分離,這使得確定抗體特異性更容易。 然而,總是值得考慮引入對照進行驗證的重要性,特別是對于印記膜的定量。

 

陽性和陰性

陽性對照是Western印跡中最廣泛使用的,有幾種類型可用。 全長重組蛋白質作為理想的陽性對照,因為它們應該與天然蛋白分離是相同的,如果產生標準曲線,也可以用作進一步定量的標準品。 然而,重組蛋白不能使用的,因為成本可能是令人望而卻步的。 在這些情況下,可以使用陽性細胞或組織樣品,包括已被修飾以過度表達感興趣的蛋白的樣品。

在另一個方向上,陰性對照樣品也可能被用上,使用完整的空白,更好的對照是缺乏目的蛋白的裂解物。 如果感興趣的蛋白質是相對組織特異性的,或者可以通過敲除產生。

發布者:艾普拜生物科技(蘇州)有限公司
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